Способ определения фибронектина в плазме крови

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для количественного определения фибронектина в плазме крови. Цель - повышение чувствительности, точности способа и его упрощение. В предварительно адсорбированные пробы плазмы крови вносят специфические антифибринонектиновые антитела, эритроцитарньй диагностикум и по образованию агглютинатов определяют содержание фибронектина. Эритррцитарный диагностикум приготовляют из формалинизированных эритроцитов в присутствии дубильной кислоты . Сенситином является фибронектин, выделенный из крови человека или лошади ,. В сравнении с прототипом обеспечиваются чувствительность (более чем в 70- 120 раз), точность способа и достигается его упрощение. о (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (51)4 G 01 N 33/53

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21) 4123731/28-14 (22) 26 .09.86 (46) 15.03.89. Бюл. и 10 (71) Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии, 1-й

Московский медицинский институт им.

И,М.Сеченова и Всесоюзный научно-исследовательский институт биотехнологии (72) Н.Н.Басова, Е.В.Сокуренко, Н.Л.Кахновская, И.Б.Богин, В.И.Огарков и С.В.Сурис (53) 615.373(088.8) (56) R-G. Baluna,О. Ваеас, КЛатиач. schi. 1. Belascu — I Immunolog .;

Methods, 1985, v. 79, р,65-70. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИБРОНЕКТИНА

В ПЛАЗМЕ КРОВИ (57) Изобретение относится к медици1

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для количественного определения фибронектина в плазме крови.

Цель изобретения — повышение чувствительности и точности способа, его упрощение.

Способ осуществляют следующим образом.

Предварительно адсорбированные пробы плазмы испытывают в трехкомпонентной серологической реакции нейтрализации антител с дозированным количеством специфической антисыворотки против фибронектина и стабильным диагностикумом, полученным в.результате последовательного сведения стабилизированных альдегидом эритроци„„Я0„„1465769 А1 не и может быть использовано для количественного определения фибронектина в плазме крови. Цель — повышение чувствительности, точности способа и

его упрощение. В предварительно адсорбированные пробы плазмы крови вносят специфические антифибринонектиновые антитела, эритроцитарный диагностикум и по образованию агглютинатов определяют содержание фибронектина.

Эритроцитарный диагностикум приготовляют из формалинизированных эритроцитов в присутствии дубильной кислоты. Сенситином является фибронектин, выделенный из крови человека или лошади. В сравнепии с прототипом обес- с е

Ж печиваются чувствительность (более чем а 70- 120 ран), точность способа (/) и достигается его упрощение.

lick тов, дубильной кислоты и фибронекти- @ба на, с последующей фиксацией образо- 1 вавшегося комплекса альдегидом. CR

В предлагаемом способе испытуемые ес,) пробы плазмы, которые взаимодействуют © со специфической антисывороткой, а цр результат — нейтрализация антителпроверяются с помощью специфического стабильного фибронектинового эритро1 цитарного диагностикума. Срок хранения фибронектинового эритроцитарного диагностикума - 6 мес (срок наблюдения) . и

Пример. Испытуемые образцы плазмы крови разводят 1:2 — 1:4, соединяют со взвесью отмытых формалинизированных эритроцитов, инкубируют

1 ч в тепле и затем до утра на холоде

3 14657, для удаления гетерогемагглютининов.

Такая обработка не снижает содержания фибронектина в плазме.

В качестве р ефер енс-препарата lip H

5 меняют стандартный раствор фибронектина с концентрацией 450 мкг/мп, параллельно с испьггуемой пробой участ вующий в определении содержания фибронектина. Антисыворотку получают пу- 10 тем гипериммунизации кроликов фибронектином.

Для осуществления способа определения фибронектина в плазме крови готовят фибронектиновый эритроцитарный диагностикум: полученную кровь (бара.на, петуха, человека — 0 группы) деl фибринируют, осадок эритроцитов отмывают изотоническим солевым раствором, затем ресуспендируют до 8Х-ной 20 концентрации, взвесь соединяют с равным объемом изотонического раствора, содержащего З формальдегида, и инкубируют при 37 18 ч.

Затем формалинизированные эритро- 25 циты отмывают изотоническим солевым раствором, доводят до 20%-ной концентрации таким же раствором с 0,3 формальдегида и оставляют на холоде на несколько дней (полуфабрикат).

Сенситином служит фибронектин, выделенный иэ плазмы крови человека или животного (лошади) посредством аффинной хроматографии на желатин-ага.розе с этапом дополнительной очистки

35 элюата по известной методике.

Полученные образцы фибронектина в ! дозах 10, 25 и 50 мкг сводят с 5%-ной вэвесью эритроцитов (формалиниэирован-! ных, отмытых детергентсодержащим со- 40 ,левым раствором (твин-80 1:50000) и обработанных дубильной кислотой (1:

:20 000.). Инкубирование фибронектина и эритроцитов при рН 6,4, 7,4, и 7,8, при 37 продолжают в течение

1,2 или 3 ч или при 4 - 18 ч. Сравнение серий, полученных при разных условиях изготовления, не выявляет различий в характеристике конечного продукта.

Эритроцитарный диагностикум стандартизируют по густоте на ФЭК-M u применяют как 2,5%-ный в .макро- и как 0,3 -ный — в микрометоде реакции ° нейтрализации антител.

Количественное содержание фибронектина плазмы крови определяют сравнением нейтралиэующего титра референс69 4 препарата и исследуемой пробы плазмы крови по формуле;

Х>

Х = -- ° Y (/ У где Х, 7 — концентрация фибронектина в исследуемой плазме и референс-препарате соответственно;

Х,7 — нейтрализующие титры.

Воспроизводимость способа проверяют на 4 образцах плазмы, в которых определенно содержание фибронектина предлагаемым способом не менее 4 раз а использованием антисыворотки в разведениях от 1:160 до 1:51200 с интервалом в 1-2 дня. Полученные результаты совпадают (коэффициент корреляции

1,0 против О, 9, в аналогичных опытах, .в,прототипе).

Предлагаемый способ определения фибронектина в плазме крови обеспечи-. вает по сравнению с известными clIoco» бами следующие преимущества: большую специфичность за счет использования в качестве ингредиентов очищенного фибронектина и специфической антисыворотки; большую результативность за счет выявления полимеров, мономеров и. продуктов деградации фибронектина; большую чувствйт ель ность за сч ет дозированного количества антител и прочности связи их с фибронектином, техническую простоту выполнения; высокую воспроизводимость результатов за счет использования стабильного эритроцитарного диагностикума единой активности и дозированных антител, доступность и экономичность (стоимость 1 анализа — около 1 коп.);уменьшение объема крови, достаточного для определения концентрации фибронектина (менее 10 мкл.)

Повышение чувствительности дает применение дозированного количества специфических антител, минимального, но достаточногo для осуществления способа. Точность повышается за счет реализации связывания многих мест связывания в молекуле фибронектина со специфическими антителами, что позволяет определить содержание всего иммунологически активного фибронектина, вплоть до гаптенов. Боль-. шая чувствительность обеспечивается также более прочной связью фибронектина в плазме крови с антителами go ,сравнению с желатиной и достигает

0,1-0,5 мкг/мл в предлагаемом способе

1465

Составитель В. Литовченко

Редактор И. Касарда Техвед Л.Олийнык Корректор Л. Пилипенко

Заказ 938/44 Тираж 788 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент"., г. Ужгород, ул. Гагарина,!01

5 (7,0-60,0 мкг/мп по прототипу). В прототипе используют нативные эритро-; циты, что приводит к частому приготовлению и стандартизации субстратов реакции, что значительно усложняет

5 определение фибронектина в клинике; в предлагаемом способе для этих целей применяют стандартные .формалинизированные эритроциты. l0

Эормула изобретения

Способ определения фибронектина в плазме крови, включающий сенсибилиза769 б цию эритроцитов белком, добавление их в исследуемую пробу с последующим определением по агглютинации эритроцитов содержания фибронектина, о тл и ч а ю шийся тем, что, с цельц повышения точности способа и его упрощения, эритроциты сенсибилизируют фибронектином, а перед добавлением их в исследуемую пробу ппазму адсорбируют несенснбилизированными эритроцитами и вносят специфические антитела.