Способ определения специфической сенсибилизации организма к аллергенам

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧ ЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 G 01 N 33/53

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

flQ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4076201/28-14 (22) 02.06.86 (46) 07.03.89. Бкл. Ф 9 (71) Челябинский государственный медицинский институт (72) И.И.Долгушин, JI.ß.Эберт, Е.Ю.Беломестнова, Л.В.Мельник и А.В.Зурочка

:(53) 615.375(088.8) (56) Новиков Д.К., Новикова В.И.

Клеточные методы иммунодиагностики.—

1979, с. 186, 196. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОИ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ ОРГАНИЗМА К АЛЛЕРГЕНАМ .(57) Изобретение относится к области иммунологии и может быть использовано при диагностике аллергий. Цель

Изобретение относится к клинической медицине,.точнее к клинической аллергологии и иммунологии, и предназначено для выявления специфической сенсибилизации к аллергенам у больных с аллергической патологией.

Цель изобретения — повышение точности определения специфической сенсибилизации к аллергену.

Способ осуществляют следующим образом.

Моноциты и полинуклеары выделяют из периферической крови путем центрифугирования на двойном градиенте фиколл-верографин. После троекратного отмывания средой 199 клетки инкубйруют в. концентрации 10 /мл в те6 чение 60 мин в пробирках "сапожках".

Культуру клеток, прилипших к стеклу, .SU» 1464088 А1 изббретения — повышение точности определения специфической сенсибилизации организма. У больного из крови выделяют моноциты, нейтрофилы, добавляют к HHM аллерген и инкубируют

45 — 75 мин. Далее определяют процент прилипших моноцитов и нейтрофилов, а также лизосомальную активност моноцитов. При увеличении процента прилипших моноцитов более чем в

1,5 раза при одновременном снижении процента прилипших нейтрофилов и повышении лизосомальной активности моноцитов в 1,7 раза по сравнению с пробой без аллергена диагностируют специфическую сенсибилизацию к аллергенам. Точность способа возрастает на 40Х. отмывают от лимфоцитов, добавляют аллерг ены (специфические и неспецифические), инкубируют в течение 4575 мин. Определяют индекс суммарной люминесценции лизосом в моноцитах и клеточное соотношение М„/Н4,. При увеличении процента прилипших моноцитов более чем в 1,5 раза и повышении лизосо мальной активности мононуклеаров более чем в 1,7 раза по сравнению с контролЕм диагностируют специфическую сенсибилизацию к аллергену.

Пример 1. Изучали способность моноцитов и нейтрофилов периферической крови больного бронхиальной астмой атопической формой отвечать на воздействие специфического аллергена (аллерген домашней пыли)

in vitro. С этой целью выделяют гра1464088 нулоциты и мононуклеары из перифери( ческой крови путем центрифугирования на двойном градиенте фиколл-верографин.

На границе между плазмой и раст5 вором фиколл-верографин образовалось кольцо, содержащее 10-15 моноцитов, 10-18 нейтрофилов, 67-802 лимфоцитов. После выделения клеточную 10 взвесь — суспензию трижды отмывают средой tq9. Клетки инкубируют в концентрации 106/мп в течение 60 мин при 37 С в пробирках "сапожках", на дне которых находились покровные стекла. Затем клетки, прилипшие к ( стеклу, отмывают от лимфоцитов средой 199 и используют их для изучения специфической сенсибилизации -к ал-! лергену. 20

Исследование проводят двойным слепым методом. Испытатель и учетчик не знали, какой аллерген является специфическим. Клетки инкубируют в среде 199 с добавлением 200 .РПИ/мл двух аллергенов, один из которых был специфическим (аллерген домашней пы( ли —. опыт), а другой. неспецифическим (аллерген пыльцы деревьев — контроль 2). Общим контролем служили 30 клетки, инкубированные без аллергена

СИЛ = 1а + ЗЪ + 10с, 25

Ф соотношение Мц/Н в

ИС

1 соотношение М;, /Н < в

СИЛ в опыте (или в контроле 2)

СИЛ в контроле 1

40 Соответственно ИС g со специфическим аллергеном составил ИС = 2,23, а с неспецифическим ИС = 1, 24 .

Пример 2. Больной X.À.È. Диагноз: туберкулез легких.

45 Изучали способность моноцитов и нейтрофилов периферической крови у больного в фазе выраженной активности процесса отвечать на воздействие специфического аллергена (туберкули50 на) . Исследование проводили аналогично осуществлению способа в примере 1. В качестве спепифического аллергена использовали стандартный сухой туберкулин.

Содержание ампулы разводили в

1 мл среды 199. В реакции использовали 0,1 мп полученного раствора туберкулина. Неспецифическим аллергеном служил бруцеллин (0,1 мл) .. где ИС вЂ” соотношение клеточных эле-.

1 ментов;

ИС вЂ” с оот ношение СИЛ ли з ос Ьм активных моноцитов.

У больного К.В.И. процент моноцитов в среде 199 составил 38, соответственно М /Н ф = 0„61; при инкубации с неспецифическим аллергеном (смесь пыльцы деревьев): 47 . моноцитов, а соотношение Мц/Н ф = 0,89; со специфическим аллергеном (аллерген домашней пыли): 70 .моноцитов, М„/Н ф 2,33. Соответственно ИС .со специфическим аллергеном ИС = 3,82, с неспецифическим аллергеном ИС „ =

1,46.

СИЛ лизосом в моноцитах при инкубации в среде 199 составил 168 .ЕД„ со специфическим аллергеном — 375 ЕД с неспецифическим аллергеном — 208.ЕД (контроль 1) в течение того же времени. Специфичность аллергена нодтверждалась многократными кожными пробами. По истечении срока инкубации и в опыте и в контроле подсчитывали соотношение моноцитов и нейтрофилов, прилипших к стеклу (моноцит/нейтрофил) . В мазках подсчитывали не менее 100 клеток. В оставшихся

"сапожках" клетки отмывали от аллергена средой 199 и инкубировали с акридином оранжевым в концентрации

2 мкг/мл в течение 20 мин, после чего определяли суммарный индекс люминесценции (СИЛ) лизосом полуколичественным методом по формуле где а — количество клеток, содержащих единичные лизосомы;

Ь вЂ” количество клеток, лизосомы в которых занимают 50-.70 цитоплазмы: с — количество клеток, цитоплаз-, ма которых полностью заполненаа ли з ос омами .

Для облегчения учета реакции проводили подсчет индекса сенсибилизации (ИС) по формуле

I опыте (или контроле 2)

В контроле 1

1464088 мого способа можно точно определить, какой аллерген является специфическим. В данном примере специфическая реакция определяется на туберкулин, что соответствует иммунной реактивности при заболевании туберкулезом.

Положительный эффект заключается в том, что уменьшается количество ложноположительных результатов с 40Х до О, т.е. точность возрастает íà 40Х.

Формула изобретения

Составитель Г. Крюкова

Редактор И. Горная Техред Ы.Дидык Корректор И. Патай <

Заказ 819/48 Тираж 788 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

Процент моноцитов у данного больного в среде 199 составил 43Х, соответственно Мц/Н ф = 0,75, при инкубации с неспецифическим аллергеном (бруцеллином) содержание моноцитов

53Х, а соотношение М„/Нф = 1,12, со специфическим аллергеном (туберкулином) — 76Х моноцитов,М„/Н ф = 3,17.

ИС, со специфическим аллергеном равен 4,2, ИС, с неспецифическим аллергеном равен 1,4.

СИЛ лизосом в моноцитах при инкубации в среде 199 составил 273 ЕД, со специфическим аллергеном 418 ЕД, а с неспецифическим аллергеном 306 ЕД.

Соответственно ИС со специфическим аллергеном составил 1,53., а с неспецифическим аллергеном 1,12.

Проведение исследований в соответ-20 ствии с известным способом дало следующие результаты: при инкубации клеток в среде 199 для подсчета 100 лейкоцитов просмотрено 27 полей зре-. ния, при инкубации с неспецифическим 25 аллергеном — 44 поля зрения, при инкубации со специфическим аллергенбм—

31 поле зрения.

Соответственно ИСз со специфическим аллергеном составил 1,14, а с не-З0 специфическим 1,6.

Таким образом, известный способ не позволяет оценить наличие специфической сенсибилизации, так как снижение прилипаемости более выражено с неспецифическим аллергеном, а не со специфическим. С помощью предлагаеСпособ определения специфической сенсибилизации организма к алпергенам, включающий забор крови, выделение лейкоцитов, инкубацию их в при-, сутствии аллергена с последующей оценкой адгезивной активности лейкоцитов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, из лейкоцитарной взвеси выде;ляют моноциты и нейтрофилы, инкуби руют с аллергеном в течение 45-75 мин,. далее определяют процент прилипших моноцитов и нейтрофилов и лиэосомальную активность моноцитов и при увеличении процента прилипших моноцитов более чем в 1,5 раза при одновременном снижении процента прилипших нейтрофилов и повышении лизосомальной активности моноцитов более чем в

1,7 раза по сравнению с пробой без аллергена диагностируют специфическую сенсибилиэацию к аллергенам.