Способ определения активности 7- @ -холестерингидроксилазы

 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для оценки функционального состояния системы микросомального (МК) окисления холестерина в печени. Цель изобретения - упрощение способа при снижении его инвазивности. Для этого экспериментальному животному однократно внутривенно вводят стабилизированную эмульсию <SP POS="POST">3</SP>H-холестерина, затем в моче определяют содержание <SP POS="POST">3</SP>H<SB POS="POST">2</SB>O -продукта окисления холестерина под влиянием 7-α-холестерингидроксилазы. Изобретение позволяет оценить функциональное состояние МК в сроки, когда реализуется большинство экстремальных воздействий на организм.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (511 4 С 01 И 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPGHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21 ) 4246275/28-1 4 (22) 27.05.87 (46) 30.04.89. Бюл. N - 16 (71) Оренбургский медицинский институт (72) В.П ° Твердохлиб, А.A. Никоноров, В.К. Филиппов, Б.А. Фролов, С.Н. Афонина и Ф.З. Меерсон (53) 612.01 5(088.8) (56) Лопухин 10.M., Арчаков А.И.

Владимиров IO.À., Каган Э.M. Холестениноз. М.: Медицина, 1 983, с. 268. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

7-сС-ХОЛЕСТЕРИНГИДРОКСИЛАЗЫ (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для

Изобретение относится к биологии а именно к биохимии, и может быть ис. пользовано для оценки функционального состояния системы микросомального окисления холестерина в печени путем определения активности Фермента 7 -

-холестерингидроксилазы.

Цель изобретения — упрощение способа при одновременном снижении его инваэивности.

Способ осуществляют следующим образом.

1 . Приготовление альбумин-стабилизированной эмульсии.

250 мкл 7(n)p — Н Cholestегоl фирмы Amersham с общей радиоактивностью

250 мкКи, растворенного в толуоле, высушивали в токе азота, затем быстро добавляли 0,5 мл ацетона.

Полученный раствор медленно, редкими каплями добавляли при энергич-. ном перемешивании на аппарате типа SU» 14 380 А1 оценки функционального состояния микросомального (МК) окисления холестерина в печени. Цель изобретения — упрощение способа при сниже.нии его инваэивности. Для этого экспериментальному животному однократно внутривенно вводят стабилиэи3 рованную эмуль сию Н-холестерина, затем в мочЬ определяют содержание

Н О-продукта окисления холестерина под влиянием 7- -холестерингидроксилазы. Изобретение позволяет оценить функциональное состояние МК в сроки, когда реализуются большинство экстремальных воздействий на организм °

2 табл.

Vortex к 17 мл 10K — ного раствора альбумина. Раствор помещали в ток азота до тех пор, пока не исчезал запах ацетона.

Радиоактивность полученной эмуль— сии определяли, помещая 5 мкл ее в

1 0 мл сцинтилляиионной жидкости ЖС-8.

Радиоактивность эмульсии состав6 ляла 32,5 10 имп/мин в расчете на 1 мл эмульсии.

2. Введение радионуклида в кровь, У.крыс линии Вистар массой 180200 г под легким эфирным наркозом обнажали бедренную вену и вводили в нее 0,4 мл альбумин-стабилизированной эмульсии Н-холестерина. Кровотечение останавливали электрокоагуляцией, рану закрывали двумя кож ными швами. Двигательная активность животных полностью восстанавливась .в течение 1 ч после введения радионуклида.!

476380

3. Сбор мочи для исследования наличия Н О.

Использовали способ сбора спонтанно выделенной мочи. Для этого животных аккуратно извлекали из клеток ., и помещали на чистую сухую стеклянную поверхность. Через 15-20 с наступало самопроизвольное мочеиспускание. Мочу собирали пастеровской пипеткой в мер-!О ную пробирку. Процедуру повторяли

3-4 раза через 30-40 мин, добиваясь получения l 1,5 мл мочи.

4. Перегонка мочи, получение дис- тиллята . 15

К 1 мл мочи добавляли 1 мл 207-ной

ТХУ (трихлоруксусная кислота), встряхивали и подвергали дистилляции в микродистилляторе до получения 0.,40,6 мл воды. 20

5. Счет радиоактивности дистиллята.

Радиоактивность полученнЬй тритиевой воды измеряли на сцентилляционном счетчике LS 100 фирмы Beckmani 25

Для этого 0,4-0,6 мл дистиллята помещали в 10 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-8 и определяли активность счета,:имп/мин, Радиоактивность тритиевой воды рассчитывали на l мл 30 мочи.

Пример 1. Изучали динамику выведения тритиевой водь1 с мочой по сле однократного введения животным (белым крысам) 0,4 мл альбумин-стабилизированной эмульсии 7.(n)оь HCholestегоl фирмы Amersham с общей радиоактивностью введенной дозы 6 6—

Э

13" 10 ипм./мл мин около 10-15 мкКи на животное. Полученные данные свидетельствуют о том, что уже через

2 и 4 ч после внутривенного введения изотопа в моче появляется и быстро нарастает радиоактивность, обусловленная Н О. Максимум ее приходится з 45 на вторые сутки после введения меч е1 ного холестерина (ЗН-ХС) .. Затем следует постепенное снижение радиоактивности, отражающее естественную убыль ХС, введенного в организм за счет его гицроксилирования и других метаболических превращений. Динамика выведения тритиевой воды с мочой прослежена до 16 сут, когда радиоактив-» ность мочи составляла 27-31 от максимальной, отмеченной на вторые сутки.

Наиболее динамичные изменения отмечены в первые 5-6 дней после введения меченого ХС, т.е. в сроки, когда реализуются большинство экстремальных воздействий на организм. Полученные данные представлены в табл. 1 .

Пример ?. Изучали скорость окисления холестерина под влиянием эмоционально-болевого стресса. Ди— намика выведения с мочой Н. О отра-. жает скорость ее образования и; следовательно, активность 7- - холестерингидроксилазы у контрольных животных (и-8) и крыс, перенесших эмоционально-болевой стресс (n-11) .

Эмоционально-болевой процесс в виде невроза тревоги воспроизводили по стандартной методике Десидерато .(1 974) . Стрессорное воздействие продолжалось 6 ч . Животных брали в опыт через 1 ч после прекращения стрессового воздействия.

Полученные результаты представлеt ны в табл. 2. !

В табл, 2 показана радиоактивность дистиллята мочи животньй, перенесших эмоционально-болевой стресс (введено 0,4 мл альбумин-стабилизированной эмульсии Н-холестерина, имп/мин).

Снижение скорости образования Н О отражает стрессорное ингибирование активности 7- -гидроксилазы ХС в первые 2 сут после стресса. Затем активность постепенно нормализуется.

Предлагаемый способ определения уровня гидроксилирования ХС в эксперименте ин виво позволяет наблюдать динамику этого процесса у интактных животных и перенесших экстремальное воздействие, а также позволяет оце-. нить защитный эффект химических мембранопротекторов и адаптационных способов защиты биологических мембран печени. Способ может быть использован для изучения и прогнозирования процесса атерогенеза.

В сравнении с известным предлагаемый способ обеспечивает упрощение и неинвазивность за счет отсутствия необходимости отбора крови. формула изобретения

Способ определения активности

7-о -холестерингидроксилазы путем введения экспериментальному животному меченого Н-холестерина с после з дующим отбором и исследованием биологической жидкости на содержание

Н О, отлич ающийс я тем, !

476380 6 эмульсию 3Н-холестерина, которую вводят внутривенно однократно, а в качестве биологической жидкости используют мочу.

Таблица l что, с целью упрощЕния способа при одновременном снижении его инвазивности, в качестве источника Н-холес3 терина используют стабилизированную

Радиоактивность дистилляте мочи контрольных хивотных после введения 0,4 мп алъбумин-стабилизированной эмульсии Н-холестерииа (тип!мин) Радиоактивность, имп/мин

Животное

Время отбора проб мочи после введения радионуклида

24 ч 48 ч 72 ч 4 сут 5 сут 6 сут

2-4 ч 7 сут

1 2079 . 8026 ) 5481 !4345 1735 12220

Не отби- 13750 рапи

То хе

13114

2 2433 2250 28069 22070

13728 !

3221

15317

11600

M+m 4,4t0,7 12,7+1,5 22,0+2,2 19,5«+),3 16,8g),2 13,7+! 13,5+1 13,3+0,6 тыс яч нмп/мйн.

Таблица. 2

Радиоактивность, wn/мин

42 ч 72 ч 4 сут 5 сут

Живот ное

Время отбора проб мочи после введения радиоиуклида

-4ч 24ч

6 сут

7 сут

1 Не отбирали

2 2941

3 Не отбирали

5125 15797 ) 4915

731 ). ) 6222 3836

13613 "Не отби- ) 7694

PRllB

5974 1 6897 I 7747

I 0333 21 896 20267

11 231 13733 18714

6814 13420 13838

9609 )4386 13739

9929 17097 20302

8083 15542 )5012

1 4768

) 5378

2031 6

1 5603

Не отбирали

136) 9

4 3145

5,. 3) 45

° .6 555)

7 3905

8 4232

9 3905

I 0 2614 .

«н

° f

21825 158)1

2251) 20609

14420 Не отбирали

14552 12376

11 029 )1421

1 6667 1 6333

Не отби- 16575 рали

)8220 )1 581

1 2771

I 5250

1 6046

13824

15037

1 1573

I I 7561

4680 14661 20222

l 3 I 92

Э

8,4 0,9 ) 6+0,9 17+0,6 16,9+I, l 14,9+0,9 14,3+0,5 11,7+1,1

М+а 4,1 +0,4 тыс яч ют/мин

Составитель Н. Гуляева

Техред Л.Олийнык

Корректор М. Пожо

Редактор М. Петрова

Заказ 21 50/45 Тираж 790 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород,.ул. Гагарина, 101

4

6

3144

Не отбирали

631 О

6538

7150

) 0333 31872

10286 24171

11480 15311 ! 95! 2 2! 536 ! 2398 19659

17617 19496

20568

16714

19063

23872

20781 ! 8958

Не отби-) 8630 рапи ! 9977

1 6030

16888

)8083

18039

16983

1) 969

14224

I I l 97

I 4276

12217

1 I

15)78 Не отбиралн

13161 То ае

15864

14333

1 0950

12443

7740 ! 1392 . 1013

13033

1 2420

1I 580

13228

15771

12815