Способ определения диклофенака натрия в биологической жидкости
Изобретение относится к методам определения вольтарена в биологических жидкостях. Цель изобретения - повышение чувствительности способа - достигается тем, что определение ведут по цветной реакции вольтарена с пероксидом водорода и пероксидазой, а окрашенный продукт реакции измеряют при 450-460 нм. Способ позволяет определить 0,5 мкг диклофенака натрия в 3 мл пробы. 8 табл., 1 ил.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (я) 4 С 01 N 33/48
ОПИСАНИЕ HSOEPETEhNH
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ
ПРИ ГННТ СССР (21 ) 4230043/28-14 (22) 15.04.87 (46) 07.04.89 ° Бюл. № 13 (7)) Винницкий медицинский институт им. Н,1I.Пирогова (72) А.А.Пентюк, Н.А.Станиславчук, Н.Б.Луцюк, А.П.Лычко и Л.M.Ñòàíèñ azvyz (53) 612.015(088.8) (56) Фармацевтический журнал, 1984, ¹ 4, с.46-49.
Изобретение относится к области медицины, а именно к биологическим методам исследования, и может быть использовано для определения количества вольтарена в биологических жидкостях или лекарственных формах.
Цель изобретения — повышение чувствительности способа.
Постоянная цель достигается тем, что используется цветная реакция вольтарена с пероксидом водорода и пероксидазой при рН инкубационной среды в интервале 7,2-7,7.
На чертеже приведена калибровочная кривая для определения вольтарена.
Способ осуществляется следующим образом.
К пробе, содержащей вольтарен, прибавляют О,1 моль калий-фосфатный буфер с рН 7,2-7,7 раствор пероксидазы до конечной активности 4-10 ед. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИКЛОФЕНАКА
НАТРИЯ В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ (57) Изобретение относится к методам определения вольтарена в биологических жидкостях. Цель изобретения — повышение чувствительности способа— достигается тем, что определение ведут по цветной реакции вольтарена с пероксидом водорода и пероксидазой, а окрашенный продукт реакции измеряют при 450;460 нм. Способ позволяет определить 0,5 мкг диклофенака натрия в 3 мл пробы. 1 ил,, 8 табл. на 3 мл пробы, раствор пероксидаза водорода до конечной концентрации
0,49-1,96 мкмоль/3 мл пробы, а оптическую плотность окрашенного продукта измеряют в интервале 30-60 мин при
450-460 нм.
Максимальный выход окрашенного продукта наблюдается при рН инкубационной среды в интервале 7,2-7,7, в промежутке 30 — 60 мин после прибавления реактивов (табл.1.).
Максимальная плотность окрашенного продукта наблюдается при концентрации пероксидазы в пробе в интервале 4-10 ед активности на 3 мл. Зависимость оптической плотности окрашенного продукта от концентрации пе— роксидазы в пробе приведена в табл.2.
В работе использован извсстный препарат пероксидазы из хрена с исходной активностью 650 ед/мг. Непосред1471131 ственно перед использованием проверяли активность препарата по методу
Симакова. Обесцвечивание индигокармина определяли спектрофотометрически за 1 мин. Сухой препарат пероксидазы растворяли в дистиллированной воде до концентрации 20 — 120 ед. активности (мкмоль обесцвеченного индигокармина/мин) в 1 мл.
Максимальная оптическая плотность окрашенного продукта наблюдается при кднцентрации пероксида водорода в интервале 0,49-1,96 мкмоль/3 мл пробы.
В табл. 3 приведена зависимость оптической плотности окрашенного продукта от количества пероксида водорода в пробе.
Максимум поглощения окрашенного продукта находится в интервале 450460 нм (табл.4). Это свидетельствует, что в результате реакции пероксида водорода и пероксидаэы образуется с вольтареном качественно отличный комплекс по сравнению с известным.
Максимум поглощения окрашенного продукта взаимодействия вольтарена с пе. рийодатом натрия находится при 550 нм.
Проведено экспериментальное сравнение чувствительности предлагаемого способа. определения вольтарена с таковой у известного. Оказалось, что чувствительность предлагаемого спосо35 ба примерно в 10 раз превосходит таковую в известном (табл. 5) . Линейная зависимость между количеством вольтарена и величиной оптической плотности, как видно из табл.5 и черте 40 жа, сохраняется в интервале 0,5
30 мкг.
Воспроизводимость способа была проверена на пяти параллельных определениях (табл.б). Коэффициент вариа- 45 ции составляет 2,24%, 1
Специфичность способа определения вольтарена была проверена на препаратах. назначение которых сОвместно с
50 вольтареном наиболее вероятно (табл. 7) . Оказалось, что анальгин, индометацин, аспирин, эуфиллин не дают окрашенного продукта в условиях определения вольтарена. Лмидопирин в этих условиях дает слабо окрашенный продукт с другим максимумом поглощения (580 м), который к тому же исчезает в течение 10-15 мин.
Возможность определения вольтарена в лекарственных формах была проведена на иньекционном препарате вольтарена производства фирмы Плива (Югославия) в сотрудничестве с фирмой
Сиба-Гейги. Оказалось, что содержание вольтарена в препарате, определенное предлагаемым способом, составляет 73,8 мг в 3 мл, что практически совпадает с концентрацией вольтарена, указанной в рецептуре — 75 мг/3 мл.
Возможность определения вольтарена в биологических жидкостях была пронерена на плазме крови и моче, к которым были добавлены различные количества вольтарена. Опыты показали, что прямое определение вольтарена в биологических жидкостях невозможно, так как после добавления реактивов окраска не развивается, Для определения вольтарена в биологических жидкостях необходима предварительная экстракция.
Вольтарен иэ плазмы крови и мочи экстрагировали органическими растворителями из подкисленных проб. В качестве растворителя использован хло роформ. Для подкисления проб использовали 2,5 и. раствор фосфорной кислоты. Для оценки полноты экстракции вольтарена из биологических жидкостей были проведены опыты. Использованный способ экстракции обеспечивает практически полное извлечение вольтарена, добавленного к пробам плазмы крови и мочи (табл.8).
С целью проверки специфичности способа экстракции экстрагировали также пробы плазмы крови и мочи людей, не получавших вольтарен. Опыты показали,.что из биологических жидкостей не экстрагируются вещества, способные давать цветную реакцию с пероксидом водорода и пероксидазой.
Определение концентрации вольтарена предлагаемым способом в плазме крови больных, получивших вольтарен
B процессе лечения ревматоидного артрита, показало близкие величины по отношению к результатам определения вольтарена другими методами. Через
30 мин после перорального введения
100 мг вольтарена в плазме крови больного было обнаружено 1,85 мгк/мл вольтарена. По известным данным че" рез 30-60 мин после введения вольтарена в дозе 100 мг в плазме крови!
20
30
5 14711 больных выявляется 1,0 — 2,9 мкг/мл вольтарена, Пример 1. Определение вольтарена в инъекционнам препарате.
Реактивы: препарат пероксидазы из хрена производства НПО "Биохимреактив", r. Олайне, СССР с исходной активностью 650 ед/мг растворяли в дистиллированной воде и проверяли
era активность по методу Симакова. дпя работы использовали препарат, содержащий 40 ед, активными (мкмоль обесцвеченного индигакармина/мин) в мл; 9,8 ммоль раствор пероксида водорода (0,02 мл 33%-ного раствора пероксида водорода растворяли в 20 мл воды); О,! моль калий-фосфатный буфер, рН 7,4.
Ход определения.
Инъекционный препарат вольтарена фирмы Плива с содержанием вольтарена
75 мг/3 мл разводят B 100 раз дистиллированной водой.
К 0,1 мл разведенного раствора вольтарена прибавляют 2,7 мл калийфосфатного буфера (pH 7,4), затем
0,1 мл раствора пераксидазы и 0,1 мл раствора пероксида водорода, пробу перемешивают, Через 45 мин пробы фатометрируют при 455 нм на спектрофотэметре против контроля, который "одержит все реактивы, кроме вольтарена.
Расчет ведут па калибровочной кривой.
Пример 2. Определение вольтарена в плазме крови и моче.
Реактивы: хлороформ, 2,5 н.раствор фосфорной кислоты; раствор пероксида- 40 зы, содержащий 40 ед. активности в
I мл (приготовление аналогично примеру I); 9,8 падаль раствор пероксида водорода; 0,1 моль калий-фосфатный буфер, рН 7,4.
Ход определения, K об. плазмы крови или мочи прибавляют 4 об, 2,5 н. раствора фосфорной кислоты и 5 об. хлороформа к
1 мл плазмы прибавляют 4 мл 2,5 н. раствора фосфорной кислоты и 5 мл хлороформа
Пробы перемешивают путем переворачивания (не допуская вспенивания) в
31 6 течение 15 мин. После расслоения фаз хлороформный слой переносят в другую пробирку, К ос.татку прибавляют такое же количество хлороформа и повторяют экстракцию, Хлораформные экстракты объединяют и упаривают досуха при 40
60 С.
К сухому экстракту прибавляют
2,8 мл О,! моль калий-фосфатного буфера рН 7,4, затем О,! мл раствора перакси азы и О,! мл .раствора пероксида водорода и пе-ремешив ают.
Пробы фатаметрируют через 45 мин при 455 нм против контроля, который соде жал все реактивы, кроме экстрак— та в алт- т аре на .
При концентрации вальтарена в плазме крови менее I мкг/мл можно использовать микрокюветы, пропорционально уменьшив количества прибавляемых реактивов или увеличить объемы плазмы взятых для экстракции, Использование предлагаемого способа определения вольтарена, более чувствительного (в 10 раэ) по сравнению с известным, позволит определять канцен-.рацию вальтарена в биологических жидкостях не толька в с учае этравления этим препаратам, чo и кан.-.ралиравать его уровень в крови болььъ.х в процессе лечения. Это дает возможность при неабхоцимасти проводить коррекцию доз вольтарена и тем самым повысить качест"..с лечения.
Формула и з о б р е т е н и я
Способ определения диклофенака натрия в биологической жидкости путем экстракции, добавления к экстракту реагентов с последующим фотаметрираванием раствора окрашенного продукта, отличающийся тем, чта,. с целью повышения чувствительности способа, в качестве реагентов используют раствор пероксидазы в концентрации
I 3-3,3 ед./мл, раствор перекиси водорода 0,49-1,96 мкмоль, буферный раствор с рН 7,2-7,7, а фотаметрирование проводят через 30-60 мин после смешивания реагентов при 450-460 нм.
1471131
Т а блица 1 рН среды
Величина оптической плотности за время после прибавления реактивов, мин
15 . 30 45 60 90
0,440
0,500
0,350
0,330
0,320
0,300
0,280
0,180
0,080
0,180
0,290
0,575
0,605
0,610
0,600
0,510
П р и м е ч а н и е. Б каждой пробе объемом 3 мл содержалось 20 мкг вольтарена, 4 ед. активности пероксидазы и 0,98 мкмоль пероксида водорода, Таблица 2
Величина оптической плотности за время после прибавления реактивов, мин
Количество пероксидазы в3мл пробы, ед. активн °
15 30
2,0 0,175 0,510
4,0 0,350 0,605
6,0 0,490 0,600
8,0 0,590 0,600
10,0 0,600 0,590
12,0 0,610 О, 460
П р и м е ч а н и е. В каждой пробе объемом 3 мл содержалось 20 мкг вольтарена, 0,98 мкмоль пероксида водорода, рН инкубационной среды 7,4.
Таблица 3
Величина оптической плотности за время после прибавления реактивов, мин
Количе" ство пероксида водоро" да, мкмоль/
/3 мл
45
90!
5 30
0,395
0,420
0,430
0,430
0,405
0,385
П р и м е ч а н и е. В каждой пробе обьемом 3 мл содержалось 20 мкг вольтарена, 4 ед. активности пероксидазы, рН среды 7,4.
6,0
6,5
7,0
7,2, 7,4
7 5
7,7
8,0
0,)25
0,245
0,49
0,98 !,96
3,92
0 240
0,350
0 500
0,580
0,585
0,580
0,565
0,360
0,375
0,465
0,595
0,595
0,585
0,485
0,110
0,220
0,450
0,590
0,600
0,600
0,590
0,480
0,420
0,600
0 610
0,605
0,605
0,540
0,340
О., 420
0,605
0,620
0,600
0,550
0,315
0,390
0 600
0 6!О
0,6!0
0>570
О, 290
0,360
0,570
0,590
0,590
0,560
0,050
0,100
0,180
0,380
0,480
0,500
0,540
0,560
0,560
0,575
0,570
0,560
0,560
0,410
1О
1471131
Таблица 6
Таблица 4
Длина волны нм
Оптическая Длина
Оптическая плотность
Количество вольтаре5 на, мгк плотность волны, нм
20,0
20,0
20,0 гО,0
20,0
0,585
0,610
0,595
0,605
0,620
430 0,180 460
435 0,240 462
440 0,370 464
445 0,538 466
450 0,585 468
452 0,600 470
454 0,610 475
456 0,608 480
458 0,605 485
Х = 0,603
G = 0,0135
V = 2,24%
Таблица 7
IIpenapa
Количество, мг
Результат бпределения через
30 мин
Примечание. Впробеобъемом 3 мл содержалось 20. мкг вольтарена, 4 ед. активности пероксидазы, 20
0,98 мкмоль пероксида водорода, рН
7,4.
0,605 ед. опт.плотВольтарен
Индометацин 20
Анальгин 20
Амидопирин 20
Та блица 5
Количество
Величина оптической вольтарена .в пробе, мкг плотности согласно способу известному предлагае" мому
30 Аспирин
Эуфиллин
Таблица 8 добавлено определено экстракция, %
Плазма
0,96
4,82
9,35
19,8
1,0
5,0
10,0
20,0
96,0
96,4
93,5
99,0
П р и м е ч а н и е. Определение вольтарена вели следующим образом: к пробе вольтарена прибавляли 3 мл
5%-ного раствора перйодата натрия в
75%-ной серной кислоте. Окрашенный продукт фотометрировали через 15мин при 550 нм на спектрофотометре (количество раствора перйодата натрия против такового в известном способе было уменьшено с 4 мл до 3 мл для уравнивания фотометрируемых объемов в известном и предлагаемом способах).
Моча
1,0
5,0
10,0
20,0
0,95
4,88
9,78
18,8
95,0
97,6
97,8
94,0
0,5
1,0
2,5
5 0
10,0
20i0
30,0
40,0
50,0
О
О
О
О
О, 035
0,060
0,096
0,105
0,124
0,600
0,580
0,560
0,540
0,500
0,475
0,390
0,320
0,275
0,025
0,045
0,085
0,165
0,325
0,605
0,880
1,120
1,420
Величина Статистичесоптической кие параметплотности ры ности
О
О
О (слабая окраска, исчезающая через 10-!
5 мин)
О
Количество вольтарена, мкг
Примеч а ни е. Вольтарен прибавляли к пробам плазмы крови и мочи объемом 0,2 мл..1471131
f20
f00
2Ô6810
30 4.0 50
Вюльтхрен,, иа
Составитель В.Митюшин
Техред А.Кравчук Корректор M,Ïoæî
Редактор Е.Папп
Заказ 1603/47 Тираж 788
Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина,101
