Способ определения изоэлектрической точки биологической ткани

 

Изобретение относится к области биологии и медицины - к способам определения изоэлектрической точки биологических тканей и может быть применено в практике клинических, химико-токсикологических, ветеринарных лабораторий, а также при изолировании веществ из биологических объектов на заводах химико-фармацевтической промышленности. Цель - повышение точности способа. Для этого ткань гомогенизируют, фиксируют 70%-ным этиловым спиртом, окрашивают раствором зозина, избыток которого отмывают до получения бесцветных смывных вод, и раствором метиленового синего, избыток которого также отмывают водой. К отмытой ткани добавляют буферные растворы со значениями рН от 1,00 до 9,00, затем раствор отфильтровывают от осадка, а фильтрат фотометрируют при длинах волн 540 и 590 нм. Изоэлектрическую точку ткани определяют графически и находится она между минимумами светопоглощения окрашенных растворов. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (S1) 4 С 01 N 33/48

61:ЕОПЗМ

ПАТЕНТН) i, ., „„ I „" j

Б 1БЛ О

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4255092/28- 14 (22) 23.04.87 (46) 30.08.89. Бкл. У 32 (71) Курский государственный медицинский институт (72) В.И.Лобанов, М.Д.Ванина, Н.Д,Захарова и W.В.Черных (53) 612.015 (088.8) (56) Руководство к практическим занятиям по физиологии растений.

М.: Просвещение, 1968, с. 8- 12. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ТОЧКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ТКАНИ (57) Изобретение относится к области биологии и медицины - к способам определения изоэлектрической точки биологических тканей, и может, быть применено в практике клинических, химико-токсикологических, ветеринарИзобретение относится к биологии и медицине, а именно к способам определения изоэлектрической точки биологических тканей, и может быть применено в практике клинических, химико-токсикологических, ветеринарных лабораторий, в сельском хозяйстве, а также при изолировании веществ из биологических тканей на заводах химико-фармацевтической промышленности, при проведении биотехнологических исследований. Способ относится к числу массовых.

Целью изобретения является повышение точности и возможности определения изоэлектрической точки гнилостной ткани.

„„SU,„, 15 45 2 А1

2 ных лабораторий, а также при изолировании веществ из биологических объектов на заводах химико-фармацевтической промышленности ° Цель " по" вышение точности способа. Для этого ткань гомогенизируют, фиксируют

70Х-ным этиловым спиртом, окрашивают раствором эозина, избыток которого отмывают до получения бесцветных смывных вод, и раствором метиленового синего, избыток которого также отмывают водой. К отмытой ткани добавляют буферные растворы со значениями рН 1,00 - 9,00, затем раствор отфильтровывают от осадка, а филь-. трат фотометрируют при длинах волн

540 и 590 нм, Изоэлектрическую точку ткани определяют графически и находится она между минимумами светопоглощения окрашенных растворов.

3 табл.

Цель достигается тем, что растительную или животную ткань измельчают 5 мин при 5000 об/мин, берут

-6 точные навески, окрашивают 4 10 М эоэина и 4 10 Ì метиленового синего, отмывают краситель дистиллированной водой, затем помещают ткань в бу.— ферный раствор Бриттона-Робинсона на

10 мин при соотношении ткань: раствор 1:5, отфильтровывают, измеряют оптическую плотность фильтрата при длинах волн 540 и 590 нм и интервалы иэоэлектрической точки определяют графически по минимумам светопоглощения растворов.

Способ осуществляют следующим образом.

1504592

Биологическую ткань измельчают

5 мин при 5000 об/мин на микроизмельчителе ткани РТ 2; берут точную навеску, фиксируют 707.-ным этиловым спиртом, окрашивают раствором эозина, избыток которого отмывают дистиллированной водой до получения бесцветных смывов и раствором метиленового синего, избыток которого также отмы- 10 вают, к отмытой ткани добавляют буферный раствор Бриттона-Робинсона со значениями рН 2 — 9 на 10 мин при соотношении ткань:раствор, равном

1:5, затем раствор отфильтровывают 15 от осадка, окрашенный фильтрат фотометрируют при длинах волн 540 и

590 нм. Интервал изоэлектрической точки ткани определяется по минимуму светопоглощения растворов при 20

540 и 590 нм.

Пример 1. Определение изоэлектрической точки свежей ткани печени. 100,0 r печени измельчают на микроизмельчителе ткани РТ-2 5 мин при 5000 об/мин. В 9 пробирок помещают по 1,0 г (точная навеска) ткани печени, добавляют по 5 мл 707-ного этанола, тщательно перемешивают, оставляют на 10 мин, после чего спирт сливают, а в каждую пробирку добавляют по 3,0 мл 0,1%-ного водного раствора эозина, перемешивают и оставляют на 10 мин для окрашивания.

Избыток красителя отмывают дистилли- 35 рованной водой до получения бесцветных смывов. Затем в пробирку добавляют по 3,0 мл 0,05Х-ного раствора метиленового синего, тщательно перемешивают и оставляют на 10 мин для 40 окрашивания. Избыток красителя отмывают дистиллированной водой до получения бесцветных смывов. В каждую пробирку прибавляют универсальную буферйую смесь Бриттона-Робин- 45 сона со значениями рН 3, 29, 4, 10, 41 56 ° 5> 02, 5, 33, 6, 09, 6, 59, 7, 00, 8, 86, перемешивают и оставляют на 10 мин, после чего жидкость сливают с осадка, фильтруют и фотометрируют на приборе КФК в кювете с толщиной рабочего слоя 5 мм при светофильтрах с длинами волн 540 и

590 нм. По результатам измерения строят кривые зависимости оптической плотности окрашенных буферных растворов от величины рН, Интервал изоэлектрической точки свежей ткани печени определяют по минимумам светопоглощения растворов при 540 и

590 нм.

Результаты определения иэоэлектрической точки свежей ткани печени приведены в табл, 1.

Пример 2. Определение изоэлектрической точки гнилостной ткани печени. 100,0 r гнилостнЬй печени (3 мес) измельчают на микроизмель" чителе ткани РТ-2 5 мин при 5000 об./мин. В 9 пробирок помещают по

1,0 г (точная навеска) ткани печени, добавляют по 5,0 мл 707.-ного этанола, тщательно перемешивают, оставляют на

10 мин, после чего спирт сливают, а в каждую пробирку добавляют по 3,0 мл О, 1%-ного водного раствора эозина, перемешивают и оставляют на 10 мин для окрашивания. Избыток красителя отмывают дистиллированной водой до получения бесцветных смывов. Затем в пробирку добавляют по 3,0 мл

0,05 -ного водного раствора метиленового синего, тщательно перемешивают и оставляют на 10 мин для окрашивания. Избыток красителя отмывают дистиллированной водой до получения бесцветных смывов. В каждую пробирку прибавляют по 5 мл универсального буферного раствора Бриттона-Робинсона со значениями рН 3, 29, 4, 10 4, 56, 5, 02, 5, 33, 6, 09, 6, 59, 7, 00, 8, 36> перемешивают и оставляют на 10 м»н, после чего жидкость сливают с осадка, фильтруют через бумажный фильтр и фотометрируют окрашенные растворы на приборе КФК в кювете с толщиной рабочего слоя 5 мм пр» светофильтрах с длинами волн

540 » 590 нм. По результатам » мере" н»й с.троят кривые зависимости оптической плотности окрашенных буферных растворов от величины рН. Интервал изоэлектрической точки гнилостной ткани пече и определяют по минимумам светоп, глощения растворов при

540 и 590 нм.

Результаты определения изоэлектрической ткани печени-гнилостной приведены н табл. 2.

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов приведена в табл. 3.

Формула и з о б р е т е н и я

Способ определения изоэлектрической точки биологической ткани путем

5 1504592 6 приготовления препарата, окрашивания метиленового синего в течение 10 мин его последовательно эозином и мети- каждым красителем, затем отмывают леновым синим, с последующей регист- краситель водой, добавляют к ткани рацией изменения окраски и расчетом . буферный раствор Бриттона-Робинсона

5 величины рН, отличающийся при соотношении ткань:раствор 1:5 ° тем, что, с целью повышения точности выдерживают смесь 10 мин, отфильтрои воэможности определения изоэлектри- вывают и измеряют оптическую плотческой точки гнилостной ткани, ткань ность растворов при длинах волн 540 предварительно измельчают, окрашива- 10 и 590 нм с последующим расчетом венке проводят 4 10 М эозина и 4 ° 10 М личины рН.

Таблица 1

2 точка

М 1 точка пп рН МетролоТ гические рН Метрологические характеристики характеристики

6,09 Х 6,09

6,09

6,09

6,09

6,09

502 Х= 5,14

5 33 $ 0 03

5102 Ях = 0,01

5,02 с =0,03

5,33 А =+0,58Х

Таблица 2

2 точка

У 1 точка рН Метроло-. гические рН Метрологические характеристики характеристики

5,33 Х = 5,14

5,02 S = 0,17

5,02 S» = 0,08

5,33 А = +4,28K

4,56 К = 4,19

4,10 S = 0,21

4,10 S 009

4, 10 Я0 =0, 25

4,10 А = +5,97Х

Таблица 3

Сравниваемйе параметры

Известный

Предлагаемый

Свежая ткань печени

Подготовка пробы

Измельчение Гистологический срез

Количественно Произвольно

Субъективно

Объективно (визуально) Взятие пробы

Оценка результатов

1504592

Продолкение табл. 3

Сравниваемые параметры

Способ

Предлагаемый Извес тгый

Область иэоэлектрической точки одного образца, рН

Относительная ошибка, Х, для точки:

5, 14-6, 09

4,79-6,07

i12,11

+15,65

i0 58

Результаты

5 измерений совпали

Доверительный интервал для точки

0,58

0,95

f0t 03

Результаты

5 измерений совпали

Гнилостная ткань печени

Пробу взять невозмокно, 4,19-5,14 иэоэлектрическая точка не

Область иэоэлектрической точки, рН определяется

Относительная ошибка, Ж, для точки

2

Доверительный интервал для точки:

+5,97

+4, 28

0,25

0,22

Составитель А. Попов

Техред М.Дидык Корректор М.Поко

Редактор Н. Гор ват

Заказ 5247/46 Тирак 789 Подписное

ВНИИПй Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Праиэводственно-издательский комбинат "Патент", г.укгород, ул. Гагарина,101