Способ определения нарушений синтеза -цепей глобина в клетках костного мозга больных b -талассемией

 

Изобретение относится к медицинской генетике и касается способов определения нарушений синтеза глобина в клетках костного мозга. Целью изобретения является упрощение способа за счет исключения из состава среды дефицитных реактивов и сокращения числа операций. Способ осуществляется посредством инкубации клеток костного мозга больного в среде, содержащей плазму этого же больного, глюкозу и меченную аминокислоту, с последующим выделением глобина и анализом его цепей на КМ-целлюлозе.

Изобретение относится к медицинской генетике и касается способов изучения генетических дефектов человека, и может быть использовано при изучении работы генов в норме и для дифференциальной диагностики ряда наследственных болезней. Целью изобретения является упрощение за счет исключения из состава среды дефицитных реактивов и сокращения числа операций. Способ осуществляется следующим образом. Клетки костного мозга больного забирают в количестве 0,5-1 мл, помещают в среду инкубации, в которую дополнительно вводят плазму, полученную из крови того же больного, а глюкозу добавляют из расчета 20 мг на 1 мл смеси. П р и м е р. Костный мозг забирают из грудины в количестве 0,5-1,0 мл на лимоннокислой глюкозе. В это же время у данного больного берут кровь на 6% -ном растворе ЭДТА в количестве 5 мл. Осаждают клетки крови при 3000 об/мин в течение 10 мин при 2^оС, отбирают плазму и добавляют в клетки костного мозга. Затем туда же добавляют навеску глюкозы из расчета 20 мг/мл и смесь инкубируют в течение 10 мин при 37^оС. Далее вводят радиоактивный ³Н-лейцин из расчета 100 мкКи/мл (Amercham) и продолжают инкубацию в течение 2 ч при постоянном покачивании (37^оС). После инкубации к клеткам костного мозга добавляют немеченные клетки крови того же больного и все клетки промывают 3 раза раствором NKM (0,13 NaCl, 0,005 M KCl, 0,0074 M MgCl₂˙6H₂O). После отмывки и осаждения (3000 об/мин, 5 мин при 2^оС) клетки лизируют 4-5 объемами дистиллированной воды. Клеточные обломки собирают путем центрифугирования при 15000 об/мин в течение 20 мин (2^оС). Для удаления рибосом супернатант центрифугируют при 40000 об/мин в течение 2 ч при t = 2^оС. После этого 2 мл гемолизата клеток больного наносят на колонку (2 х 100 см) с сефадексом G 75, уравновешенную 0,05 М трис-HCl (рН 7,4). Элюцию гемоглобина проводят тем же буфером со скоростью 1 мл/мин. Для определения радиоактивности отбирают аликвоты объемом 0,2 мл и просчитывают их в 2 мл диоксанового сцинтиллятора. Фракции, содержащие гемоглобин, объединяют и глобин осаждают путем добавления к элюату 15 объемов кислого ацетона, охлажденного до -20^оС. Белковый осадок промывают ацетоном (-20^оС) при центрифугировании (3000 об/мин, 5 мин - 20^оС) до нейтрального рН. После однократной обработки эфиром и высушивания глобиновый белок анализируют с помощью хроматографии на КМ-целлюлозе. Осуществление способа позволяет упростить процесс определения нарушений синтеза β -цепей гемоглобина в клетках костного мозга за счет исключения из состава инкубационной среды способа-прототипа дефицитных импортных реактивов и сокращения числа операций, например фракционирования клеток в градиенте сывороточного альбумина. (56) Wood, Stomatoyannopoulos. Clin. Invest. , 1975, v. 55, N 3, р. 567-578.

Формула изобретения

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАРУШЕНИЙ СИНТЕЗА β -ЦЕПЕЙ ГЛОБИНА В КЛЕТКАХ КОСТНОГО МОЗГА БОЛЬНЫХ β -ТАЛАССЕМИЕЙ путем забора клеток костного мозга, помещения их в среду инкубации, содержащую глюкозу, меченную, аминокислоту, инкубации смеси, последующего выделения глобина на сефадексе и разделения его цепей на КМ-целлюлозе, отличающийся тем, что, с целью упрощения за счет исключения из состава среды дефицитных реактивов и сокращения числа операций, костный мозг забирают в количестве 0,5 - 1 мл, в среду инкубации дополнительно вводят плазму, полученную из крови того же больного, а глюкозу добавляют из расчета 20 мг на 1 мл смеси.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 8-2000

Извещение опубликовано: 20.03.2000        

---