Способ количественного определения реакционноспособных по отношению к пара-нитроанилидам аминокислот функциональных групп на нерастворимых носителях

 

Изобретение относится к химии полимеров и аналитической химии и позволяет проводить количественное определение реакционноспособных по отношению к паранитроанилидам аминокислот функциональных групп на полимерных и минеральных носителях с точностью выше 3% по упрощенной методике. Это достигается обработкой носителя п-нитроанилидом аминокислоты в течение 2-20 ч при 10-60°С, спектрофотометрированием при длине волны λ=310 нм и расчетом количества функциональных групп (мкмол/г) по формуле C=(N<SP POS="POST">.</SP>D<SB POS="POST">O</SB>+D<SB POS="POST">б</SB>-N<SP POS="POST">.</SP>D)<SP POS="POST">.</SP>V<SP POS="POST">.</SP>M<SB POS="POST">O</SB><SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">6</SP>/M<SP POS="POST">.</SP>N<SP POS="POST">.</SP>D<SB POS="POST">O</SB><SP POS="POST">.</SP>V<SB POS="POST">O</SB><SP POS="POST">.</SP>*98M, где D<SB POS="POST">о</SB> - оптическая плотность разбавленного раствора реактива

D<SB POS="POST">б</SB> - оптическая плотность буферного раствора, после обработки носителя

D-оптическая плотность разбавленного раствора реактива после обработки носителя

N-кратность разбавления раствора реактива до и после обработки носителя

M<SB POS="POST">о</SB> - масса навески реактива, г

V<SB POS="POST">о</SB> - объем мерной колбы, взятой для приготовления раствора реактива, мл

μ - масса навески анализируемого полимерного носителя, г

V - объем реактива, взятого для контактирования с носителем, мл

М- молекулярная масса п-нитроанилида аминокислоты. 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ.

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4157204/23-05 (22) 08. 12. 86 (46) 23.09.89 . Бюл. Р 35 (71) Научно-производственное объединение "Биолар" (72) А.Я. Озолиньш, В.А. Карклиня, M.À. Руткис, А.К. Аренс и С.К. Асаре (53) 678.537.65(088.8) (56). Турнова Я. Аффинная хроматография. M.: Мир, 1980, с. 182.

I (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫХ ПО ОТНОШЕНИЮ

К ПАРА-НИТРОАНИЛИДАИ АМИНОКИСЛОТ

ФУНКЦИОНАЛЪНЫХ ГРУПП НА НЕРАСТВОРИМЫХ

НОСИТЕЛЯХ .(57) Изобретение относится к химии полимеров и аналитической химии и позволяет проводить количественное определение реакционноспособных по отношению к пара-нитроанилидам аминокислот функциональных групп на полимерных и минеральных носителях с точностью выше ЗЕ по упрощенной методике. Зто достигается обработкой ноИзобретение относится к химии полимеров и аналитической химии, а именно к способу количественного определения реакционноспособных по отношению к пара-нитроанилидам аминокислот функциональных групп на нерастворимых носителях, и может быть использовано в биотехнологии при анализе реакционноспособных полимеров и их производных.

ÄÄSUÄÄ 150911) А 1 (59 4 В 01 J 20/26 G 01 N 21/33 сителя и-нитроанилидом аминокислоты о в течение 2-20 ч при 10-60 С, спектрофотометрированием при длине волны

> = 310 нм и расчетом количества функциональных групп (мкмол/г) по (п 0„+Рр-и Р). v m .10 формуле C-- — — — — — — — — — — — —-MnD,v где D — оптическая плотность разбавленного раствора реактива; D — оптическая плотность буферного раствора после обработки носителя; D — оптическая плотность разбавленного раствора реактива после обработки носителя; n — кратность разбавления раствора реактива до и после обработки носителя; m, — масса навески реактива, г; v — объем мерной колбы, взятой для приготовления раствора реак- . тива, мп; p — масса навески анализируемого полимерного носителя, г; v— объем реактива, взятого для контактирования с носителем, мл; M — молекулярная масса п-нитроанилида аминокислоты. 4 табл.

Цель изобретения — повышение. чувствительности и точности анализа и упрощение процессор.

Реакционноспособными функциональными группами, определяемыми согласно предлагаемому способу, являются альдегидные группы (-СНО), и-бензохиR (- NH ноновые I I диазониевые

3 1509111

Е 0 (— ЯЩ;1 ) иодацетильные (CHI-COOCH ), бромциановые (CNBr-), взаимодействующие с п-нитроанилидами аминокислот

5 (Hgc-сн-соян-©-.хо,).

В качестве п-нитроанилидов аминокислот используют и-нитроанилиды

L-лейцина, глицина, L-аланина; в качестве нерастворимых носителей используют нерастворимые носители полимерной природы либо неорганические кремнийсодержащие носители.

Пример 1 (сравнительный) .

Реактив: 1 ° 10 М раствор L-лейцинп-нитроанилида в 0,1 M фосфатном буфере рН 6,90 (25, 1 мг в 100 мл).

Навеску анализируемого носителя

О, 100 r (м = О, 100 г) контактируют в 5 колбочках с 40 мл раствора реактива 19 ч. После этого носитель со связанным п-нитроанилидом отделяют сепарацией и промывают на вакуумфильтре до полного отсутствия пнитроанилида в промывном растворе.

Отсутствие его в промывном растворе контролируют определением после гидролиза 1 M,NaOH. Промытый носитель со связанным реактивом суспендируют в 10 мл, воды, переносят в мерные колбы на 100 мл, добавляют 6 мл

1 М NaOH и гидролизу1от 30 мин при

60 С в термостатируемой водяной бане.

Потом охлаждают до комнатной температуры, нейтрализуют 1 M раствором

НС1 до рН 7, доводят колбу до метки фосфатным буфером, перемешивают и измеряют оптическую плотность раствора при 405 нм, относительно буферного раствора.

Параллельно проводят контроль на гидролиз полимера. Также берут навеску (0,100 r) самого полимера (без связанного п-нитроанилида) и проводят те же операции.

Содержание альдегидных групп .рассчитывают по формуле (D - Э )v 10

С = — Ф- — Е- — — — —, 1 м Е 1000 50 где D,- — средняя оптическая плотность (из пяти параллельных . определений) гидролиэата полимера с альдегидными группами;

D — оптическая плотность гидро- х лизата самого полимера (без, связанного и-нитроанилида);

v — объем мерной колбы для гидролизата, мл; м — масса навески полимера, г;

Š— коэффициент молярного светопоглощения при 405 нм (E=9,62 10, согласно известному способу), При м О 100 г; v 100 мл; E 9 62> ю 10 M см (согласно известному способу); 0 — 0,212; D„ 0,020)

C-20,0 мкмоль/г.

Относительное стандартное отклонение (п=5) +ЗХ.

Пример 2. Реактив: 4 ° 10 М раствор Ь-лейцин-п-нитроанилида в

0,1 M фосфатном буфере рН 6,90 (25 мг в 25 мл), Шесть навесок полимерного носителя по О, 100 r каждую (м=О, 100 r) переносят в колбочки для проведения контактирования. К одной добавляют

5 мл О, 1 М фосфатного буферного раствора, а к другим по 5 мл раствора реактива. Колбочки закрывают пробками, перемешивают и оставляют для контактирования в темном месте на

19 ч. После этого контактные растворы с реактивом и сам реактив доводят до 50-кратного разбавления буферным раствором, измеряют оптическую плотность при 310 нм.

При м О 100 г; Пк О 30; Do 1 04;

D> 0,933; и 50; M 251,3. Содержание альдегидных групп C=20,6 мкмоль/г.

Молярный коэффициент светопоглощения, выражающий чувствительность, рассчитывают по формуле

Е с е где с — молярная концентрация раствора, м- 1000

vnM

Е = 13,10з

Относительное стандартное отклонение (n = 5) + 1,5Х.

Определение концентрации.п-нитроанилида по оптической плотности при

310 нм возможно в условиях их линейной связи, что иллюстрируется данными табл, 1.

Влияние температуры на результаты анализа функциональных групп альдегидсилохромов и бензохинонсилохромов приведено в табл . 2.

Данные по примерам приведены в табл.З,.сопоставительные данные, до9 мкмоль/Г где и б

ТП, V

Таблина 1

Пример мкг/мл моль/л

2,50 ° 10

4, 18 ° 10

5,49 10

5,89 10

7,52 10

1 6,28

2 10,5

3 13,8

4 14,7

5 18,9

12,65, 10з

12,7-10

13, О 10

12 8. 10з

12,8 10

0,316

О, 531

О, 713

О, 748

0,963

Табли ца 2

Пример

Кол-во функц. групп, мкмоль

Объект исследования Функциональные Темперагруппы тура инкубации, С

Время инкубации, ч

-г

Альдегидные 5

11

65 п-Бензохиноновые 5

7 20

19,5 20

20,5 20

21 5

20 2

17 2

10 20

15 20

46 20

48 20

49 10

Альдегидсилохром

It

11

It

It и

2

4

6

8

Бензохинонсилохром

1!

11

5 1509111 казывающие преимущества предлагаемого способа — н табл. 4.

Формула из обретения!

Способ количественного определения реакционноспособных по отношению к пара-нитроанилидам аминокислот

10 функциональных групп на нерастворимых носителях путем обработки носителя растврром пара-нитроанилида аминокислоты, последующего спектрофотометрического определения продукта реакции

15 и расчета количества реакционноспособных групп, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, обработку носителя пара-нитроанилидом аминокислоты проводят в течение 2-20 ч при 10-60 С, спектрофотометрирование осуществляют при длине волны % =310 нм, а расчет количества функциональных групп С проводят по формуле

Концентрация раствора

L-лейцин-п-нитроанилида

6 (n D,+Dð)-n D) v m,.l0

МnРv и — кратность разбанления раст-. вора реактива до и после обработки носителя; — оптическая плотность разбавленного раствора реактива; оптическая плотность буферного раствора после обработки носителя; оптическая плотность разбанленного раствора реактина после обработки носителя; — объем реактива, взятого для контактирования с носителем, МП; — масса навески реактива, г; — масса навески анализируемого нерастворимого носителя, г; — объем мерной колбы, взятой для приготовления раствора реактива, мл; — молекулярная масса п-нитроанилида аминокислоты.

1509111

Кол-во функц. групп, мкмоль

Время инкубации, ч

Пример емпераура инубации, С

Н

1I

«1!«

11 !!

12

13

20

Таблица 3

Время реакции ( и-нитроРеакционно-способная группа и ее содержание, мкмоль/г

Пример Нераствориный носитель

Кол-во нм функциональных

Т проведения анапи0 .SaI С п-Нитроанилид аминокислоты

Точность он ределения (стандартное отклонение), +Х анилида, ч групп, смоль

Полимер

Альдегидная

0,5 405 20,0

L-лейцина

It !!

It

Бенэохиноновая !!

20й5

20х5

6 2

1,5

1!2

1,3

1,2

1,0

1,5

1,4

1,5

1>4

20,6

17,32

11,6

20,9

48,6

77,0

120,0

130, 0

8,1

19 310

8 310

10 310

18 3iO

20 310

2 310

2,5 310

3 310

1О 330

Глицина

L-лейцина

Глицина

Силохром !!

Полимер

II !!

Полимер

Диаэониевая, 200

Диаэониевая, 580

1,5

290 7,7

Альдегидная

1>4

310 11О

310 130

310 48,2

1!5

Ь-лейцина

Бенэохнноновая

Аньдегидная, 17,32 !

1!2

1,0

21

Бенэохиноновая

48,6

1>2

Сипохром

Сефароэа

Силохром

Бромциановая

Йодацетильная

1,2

1,5

20 310 18,6

15 310 21,2

Ь-лейцина

1 (сравтельный)

3

5

7

9

1О (конт- . рольный)

11 (контрольный)

12 (контРОЛЬНЬН1)

13 (контрольный)

14 (контрольный)

Объект исследования Функциональные группы

Альдегидная 11, 6 Глицина

Продолжение табл.2

15091l l

Показатель

Спо"o5

Прецлагаемый

Известный

4 10

1 10

О, 100

0„100

5

Е=9,62 10э

Е=13, 0 ° 1О

+1,5Х полярность раствора реактива И

Количество носителя, взятое для анализа, м, r

Количество реактива, взятое для инкубации, мл

Время инкубации, ч

Количество и продолжительность операции после инкубации:

Коэффициент молярного светопоглощения, выражающий чувствительность анализа

Относительное стандартное отклонение, выражающее точность определения (n=5) Отделение носителя сепарацией (10 мин) Промывание носителя на вакуумфильтре (5 мин) Суспендирование носителя водой и перенос в мерные колбы (5 ьын) Добавление раствора

Na0H (2 мин) Гидролиз при 60 С (30 мин) Охлаждение до комнатной температуры (5 мин) Нейтрализация кисло.той (5 мин) Разбавление буферным раствором до метки (5 мин) Измерение опт.плотностей при 5405 нм (5 мин) Табли ца 4

Разбавление раствора реактива (5 мин) Разбавление раствора после инкубации (5 мин) Измерение опт. плотностей при Э10 нм (5 мин)