Способ получения гибридных штаммов дрожжей sасенаgомyсеs cerevisiae для сбраживания крахмала

 

Изобретение относится к хлебопекарной, спиртовой и пивоваренной промышленности, в частности к технологическим процессам, связанным с утилизацией крахмалсодержащего сырья. Целью изобретения является получение штаммов, содержащих экспрессирующийся ген глюкоамилазы. Способ получения гибридных штаммов дрожжей сбраживания крахмалсодержащего сырья заключается в создании гибридов дрожжей SACCHAROMYCES CEREVISIAE, которые содержат гены, годирующие глюкоамилазу, и способны секретировать этот фермент в культуральную жидкость. С помощью способа достигается интенсивное сбраживание крахмалсодержащего сырья без предварительного осахаривания коммерческими амилолитическими ферментами или солодом. Гибриды получают путем скрещивания штамма SACCHAROMYCES DIASTATICUS CBS 1782, несущего структурный ген глюкоамилазы, и штамма SACCHAROMYCES CEREVISIAE, несущего ген-репрессор глюкоамилазы. Затем гибриды переносят на питательную среду, содержащую ацетат натрия, для индукции спорообразования, после чего изолируют споры, способные утилизировать крахмал, и скрещивают их со штаммом SACCHAROMYCES CEREVISIAE, несущим маркер ауксотрофности. Далее операции повторяют в заданном порядке до получения гибридов с эффективностью спорообразования 90-95%. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

„.SU,„, 1521767

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHGMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

М0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР . (21) 4 25866 7/30-13 (22) 09.06.87 (4Ь) 15. 11.89. Бюл. Р 42 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) С.В. Беневоленский, И.А. Нейстат, И.В. Губакина, Л,Ф. Иелешина, Е.В. Рогожкина, С.В. Иашко и О.Н. Куренная (53) 663. 14 (088. 8) (56) Технохимический контроль хлебопекарного производства, Регламент.

Министерство хлебопродуктов СССР, НПО хлебопекарной промышленности, 1975.

Авторское свидетельство СССР

Р 707964, кл. С 12 N1/18,,1977. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНЫХ ШТАММ0В ДРОЮ(НЕЙ БАССНАКОМУСЕБ CEREV181AE

ДЛЯ СБРАЖИВАНИХ КРАХМАЛА (57) Изобретение относится к хлебопекарной, спиртовой и пивоваренной промышленности, в частности к технологическим процессам, связанным с утилизацией крахмалсодержащего сырья.

Целью изобретения является получение штаммов, содержащих экспрессирующийИзобретение относится к хлебопекарной, спиртовой и пивоваренной промышленности, в частности касается технологического процесса, связанного с утилизацией крахмалсодержащего сырья с использованием пищевых дрожжей

Saccharomyces cerevisiae. (51)4 С 12 N 1/18, 15/00 //

R 1:865) 2 ся ген глюкоамилазы. Способ получения гибридных штаммов дрожжей сбраживания крахмалсодержащего сырья заключается в создании гибридов дрожжей Saceharomyces cerevisiae, которые содержат гены, кодирующие глюкоамилазу, и способны секретировать этот фермент в культуральную жидкость. С помощью способа достигается интенсивное сбраживание крахмалсодержащего сырья без предварительного осахаривания «оМмерческими амилолитическими ферментами или солодом. Гибриды получают путем скрещивания штамма Saceharomyces

diastaticus 0BS 1782, несущего структурный ген глюкоамилазы, и штамма Ф

Saceharomyces cerevisiae, несущего ген-репрессор глюкоамилазы. Затем гибриды переносят на питательную среду, содержащую ацетат натрия, для индук- ( ции спорообразования, после чего изолируют споры, способные утилизировать 2 крахмал, и скрещивают их со штаммом

Saceharomyces cerevisiae, несущим маркер ауксотрофности. Далее операции (Я повторяют в заданном порядке до получения гибридов с эффективностью спорообразования 90-95%. 1 табл.

©Ъ

Цель изобретения — получение штаммов, содержащих экспрессирующийся ген глюкоамилазы.

Способ заключается в том, что получают штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, содержащие структурный ген глюкоамилазы и неактивный аллель со3 1521767 4 ответствующего репрессора и способные использовать крахмал в качестве единственного источника углерода, секретируя глюкоамилазу в среду, с одновременным сбраживанием образующейся глюкозы. Предлагаемые штаммы дрожжей

Saccharomyces cerevisiae получены в результате нескольких этапов скрещивания дрожжей Saccharomyces diacta- 10

ticus СВ8 1782, секретирующих глюкоамилазу, с дрожжами Saccharomyces

cerevisiae из Петергофских генетических линий, ведущих двое происхожцение и от расы S. cerevisiae XII, а также с дрожжами — сахаромицнтами из

Карбондайльских генетических линий.

Предлагаемые штаммы дрожжей S. ce.revisiae имеют следующие морфологические и культуральные признаки. 20

Клетки имеют овальную, реже почти круглую форму, средний размер 6,7 х х. S,Î мкм, Размножение почкованием.

Через 96 ч инкубации на сусло-arape образуют круглые колонии, диаметром

4,0 — 6,3 мм. Край колонии ровный или слегка исчерченный, поверхность матовая. Дрожжи сбраживают глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, галактозу, рафинозу, крахмал; не сбраживают ксилозу и арабинозу. Желатину не разжижают, глицерин и спирт (этанол) усваивают. Be усваивают маннит, дульцит и сорбит.

Культуры из полученных генетических линий выращивают в жидкой среде на качалке или на агаризованных средах, содержащих один из следуюших источников углерода: глюкозу (2X) мальтозу (Z/), сахарозу (2X) или этанол (1,5/), а также пептон (1/) и дрожжевой экстракт.. {или дрожжевой автолнзат) (0,5/) в качестве источника ростовых веществ. Выращенную биомассу используют для посева в среру для 45 брожения. Посевной титр составляет

{0,5-5,0) 10 кл./мп. Среда для бро

6 жения имеет рН 5,0-6,0 и содержит кл ейстериз ованный крахмал (1, 5-4, OX) или муку (4/) . В случае использования

50 крахмала в состав среды вводят ростовые факторы — дрожжевой экстракт (0,5/) или дрожжевой автолизат (0,5 ).

Брожение проводят при 28 — 3S C в течение 48-96 ч,.Процесс сбраживания контролируют Ilo интенсивному выделе55 нию СО .

Способ поясняется конкретными при1 ирами.

Пример,1. Получение линий дрожжей S. сегеч з ае осуществляют в два этапа.

Этап 1. Генетические линии S. celev1siae получают следующим образом.

Культуру клеток S, cerevisiae CBS

1782, секретирующую глюкоамилазу и имеющую генотип STA 2 sta 10 (БТА 2 аллель, кодирующий глюкоамилазу, s ta10 — неактивный аллель ген-репрессора глюкоамилазы), выращивают на полноценной среде с глюкозой в течение

48 ч. Далее с помощью микроманипулятора выделяют отдельные клетки, которые раскладывают на полноценной агаризованной cpeqe, помещая к ним вегетативные клетки штамма S. cerevisiae Ф 117 генотипа. sta 2 STA 10 (sta 2 — отсутствие структурных геНоВ глюкоамилазы, STA 10 — ген-репрессор глюкоамилазы). Через 4 ч инкубации отбирают образовавшиеся зиготы и после этапа вегетативного размножения этих гибридов индуцируют у них спорообразование на ацетатной среде.

Гибриды имеют низкие эффективность спорообразования и выживаемость спор.

Выжившие сегреганты среди споровых потомков, изолированных при тетрадном анализе, проверяют на способность к синтезу глюкоамилазы, что проявляется в виде зоны разложения крахмала вокруг колоний, растущих на чашках с питательной средой, содержащей крахмал (1:6/) и имеющей рН 5,4.

Этап 2. Отобранные ауксотрофные сегреганты имеют генотип STA 2 sta

10 ade 5. Далее с ними проводят последовательные бэккроссы на штамм S.сегечхзЫе о- 134, который несет ауксотрофную мутацию в гене Сеп 2. При этом среди потомков каждый раз отбирают синтезирующие глюкоамилазу культуры генотипа STA 2 sta 10. В третьем поколении были получены культуры, содержащие структурный ген глюкоамилазы и секретирующие глюкоамилазу в среде. Такие культуры хорошо скрещиваются как между собой, так и с типовыми линиями S. cerevisiae, давая гибриды с эффективностью спорообразования 93Х и частотой выживаемости спор

84Х. В результате подтверждается, что созданы генетические линии дрожжей

S. cerevisiae указанного генотипа, способные секретировать глюкоамилазу и утилизировать крахмал как единственный источник углерода. ют клетки и к 9 частям культуральной жидкости добавляют 1 ч раствора амилазы в диметилсульфоксиде (50 мг/мл) в качестве субстрата ° В приготовленной таким обр а з ом р еа к ци он ной с меси и з меряют динамику накопления глюкозы с помощью глюкозооксидазопероксидазного реагента. Исходя из этой динамики рассчитывают активность глюкоамилазы в стандартных единицах (мкмоль глюкозы/

/мп мин) . Для разных культур полученной генетической линии активность составляет 0,03 — 0,05 ед. Контрольный штамм S. cerevisiae XII активностью не обладает.

Пример 5. Использование культур из полученных линий.

Набор культур 5-4А, 5-4В и 8-11С относящихся к созданным генетическим линиям, а также контрольный штамм

S. cerevisiae XII, используемый для сбраживания крахмала, выращивают в течение 48 ч на плотной питательной среде, содержащей глюкозу (2Я), дрожжевой экстракт (0,57) и пелтон (17) .

IIo истечении указанного срока клетки засевают в колбы с жидкой средой, содержащей крахмал (37) и дрожжевой экстракт (0,57) и имеющей рН 5,4. Посевной титр составляет 1 ° 10 кл./мл.

Засеянные колбы инкубируют при 30 С без аэрации для индукции брожения.

В таблице представлены результаты измерения титра клеток и характеристика брожения (по выделению CO ) в ди намик е.

Из данных таблицы видно, что гибридные штаммы S. cerevisiae способны осуществлять процесс брожения, о чем говорит интенсивно возрастающее во времени выделение СО, накапливать биомассу, используя крахмал, подвергающийся одновременному осахариванию глюкоамилазой, синтезируемой клетками. В то же время штамм S. cerevisiae

XII, используемый в способе-прототипе, такой способностью не обладает. !

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить новые гибридные штаммы дрожжей S. cerevi siae, способные производить сбраживание крахмалсодержащего сырья без предварительного осахаривания амилолитическими ферментами, Это позволяет сократить расход осахаривающих ферментных коммерческих препаратов или солода, а также исключить технологичес5 15212б 2 6

Пример 2. Этап 1. Получение линий осуществляют по примеру 1.

Этап 2. Отобранные ауксотрофные сегреганты имеют генотип STA 2 sta 10

ade 5. Далее с ними проводят последовательные бэккроссы на штамм S. cerevisiae N - 1640, который несет ауксотрофI ную мутацию в гене t гр 1. При этом среди потомков каждый раз отбирают

:синтезирующие глюкоамилазу культуры генотипа STA 2 вЕа 10. Б третьем поколении были получены культуры, содержащие структурный ген глюкоамилазы и секретирующие глюкоамилазу в среду °

Такие культуры хорошо скрещиваются как между собой, так и с типовыми линиями S. cerevisiae, давая гибриды с эффективностью спорообразования 957 и частотой выживаемости спор 90 . В 20 результате подтверждается, что созданы генетические линии дрожжей S. cerevisiae указанного генотипа, способные секретировать глюкоамилазу и утилизировать крахмал как единственный 25 источник углерода.

Пример 3. Этап 1. Получение линий осуществляют по примеру 1.

Этап 2. Отобранные ауксотрофные сегреганты имеют генотип STA 2 sta 10 30

ade 5. Далее с ними проводят последовательные бэккроссы на штамм S.Cerevisiae 3 - 193, который несет ауксотрофную мутацию в гене ura 3. При этом среди потомков каждый раз отбирают синтезирующие глюкоамилазу культуры генотипа STA 2 sta 10. В третьем поколении были получены культуры, со,держащие структурный ген глюкоамилазы и секретирующие глюкоамилазу в сре--40 ду. Такие культуры хорошо скрещиваются как между собой, так и с.тиновыми линиями S. cerevisiae, давая гибриды с эффективностью спорообразования 907 и частотой выживаемости спор бб7.. В 45 результате подтверждается, что созданы генетические линии дрожжей S. cerevisiae указанного генотипа, способные секретировать глюкоамилазу и утилизировать крахмал как единственный 50 источник углерода.

Пример 4. Определение активности глюкоамилазы.

У полученных культур S. cerevisiae определяют активность глюкоамилазы.

Для этого клетки засевают в жидкую полноценную среду, содержащую растворимый крахмал (3X) и имеющую. РН 5,4.

Через /2 ч инкубации при 30 С осажда-.

7 1521767 кий этап предварительного осахаривания, Формула изобретения

Снос об получения гибридных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae для сбраживания крахмала, нредусматривающий скрещивание штамма Яассйаromvces diastaticus СВБ 1782, несущего структурный ген глюкоамилазы, и штамма Baccharomyces cerevisiae, несущего ген-репрессор глюкоамилазы, отличающийся тем, что, с

Кул > TÓÐ а

Рост и брожение культур дрожжей на среде с крахмалом через ч

72

Титр кле- Выделение ток СО, Титр клеток Выделение Титр клеток Выделение

СО 7 СО, 1 109

2.10

1 10

9 10

1 10

8 10

5 *10

6 10

5 l0

5 l0

4 l () 5 .10

Составитель В. Голимбет

Техред Л.Олийнык Корректор В. Кабаций .1 — М

Редактор Н. Киштулинец

Заказ 6892/24 Тираж 501 Подписное

В| ИИПН Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

5-4А

"-4В

8-11С

Б.cerevisiae XII (без предварительного осахаривания крахмала) целью повыше ния штаммов, содержащих эксирессирующийся ген глюкоамилазы,, полученный в результате скрещивания, гибрид переносят на питательную среду, содержащую ацетат натрия, для индукции спорообразования, после чего изолируют споры, способные утилизировать крахмал, и скрещивают их со штаммом Saccharomyces cerevis iae, несущим маркер а уксотрофности, далее операции повторяют в заданном порядке до получения гибридов с эффективностью спорообразования 90-95%.