Способ подготовки посевного материала продуцента тилозина sтrертомyсеs fradiae

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения тилозина - антибиотика, используемого в ветеринарии. Цель изобретения - снижение потери активности. С этой целью в способе приготовления посевного материала продуцента тилозина путем высева эталонной культуры на плотную среду, отбора типичных колоний, проверки продуктивности выделенных клонов и размножения высокопродуктивных клонов пассирование с отобранными на плотной среде клонами проводят на жидкой питательной среде. 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPGHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Таблица1

Ш IV

3700 1600

3000 2600

2900 2500

2600 2400

5700 5200

5100 3800

4700 3800

3500 3000

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4362484/30-13 (22) 30.11.87 (46) 07.02,90. Бюл, 5 (71) Всесоюзный научно-исследовательский проектно-конструкторский институт прикладной биохимии (72) Н.П. Рогатых, В.Н. Давыдов, О.В. Саламаха, И.В. Савочкина, И.Л, Базаренко, Т,А, Черикова, M.П. Вишникина и И,B Бондарь (53) 615.779 (088.8) (56) Опытно-промышленный регламент производства .тилозина тартрата, У 219. — M, ВНИИбакпрепарат, 1981, Изобретение относится к биотехнологии и касается получения тилозина— антибиотика, используемого в ветеринарии.

Целью изобретения является снижение потери активности, Установлено, что исходный высокоактивный клон при требующихся в соответствии с известным способом пересевах на плотные среды прогрессивно теряет биологическую, активность.

Продуктивность клонов культуры

Streptomyces fradiae 165 при размножении на скошенной агаризованной сре7 де приведена в табл.1.

„.80„„1541258 А 1 (51)5 С 12 Р 19/62 (С 12 Р 19/62//

//C 12 R 1:54) 2 (54) СПОСОБ .ПОДГОТОВКИ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА ПРОДУЦЕНТА ТИЛОЗИНА ЯТВЕРТОMYCES FRAD1AE (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается получения тилозпна -антибиотика, используемого в ветеринарии. Цель изобретения — снижение потери активности. С этой целью в способе приготовления посевного материала продуцента тилозина путем высева эталонной культуры на плотную среду, отбора типичных колоний, проверки продуктивности выделенных клонов и размножения высокопродуктивных клонов пассирование с отобранными на плотной среде клонами проводят на жидкой питательной среде, 4 табл.

Продуктивность, ед/мл,, при генерации

Эталонную культуру Я, fradiae 165 пересевают на плотной среде, содер1541258 жащей, мас.Х: соевая мука 0,5; меласса свеклосахарная 0,5, кукурузный экстракт 0,5; крахмал 0,5; аммоний серно-кислый 0,1; натрий хлористый

0,1;.магний серно-кислый 0,05; кальций углекислый 0,2; агар 1,5; вода остальное, Проводят 4 последовательных пассажа. Продуктивность клонов каждого пассажа проверяется на жид- 10 кой питательной среде в стандартных условиях (длительность культивирования 9 суток} состав среды, мас, : мука рыбная 2,0, меласса свеклосахарная 2,0; крахмал 1,5; диаммонийфос- 15 фат 0,02; натрий хлористый 0,2; магний серно-кислый 0,2; кальций углекислый 0,5, масло соевое 3,0, вода ос,- тальное, Объем колб 350 мл, количество среды 30 мл. 20

Способ осуществляют следующим образом, Эталонную культуру S, fradiae aaiсевают на плотную среду и отбирают колонии, характеризующиеся типичными морфологическими признаками. Посев осуществляют так, чтобы на одной чашке Петри вырастало не более 50 колоний. Отобранные колонии по отдельности высевают на жидкую среду и выращивают в течение 8-12 суток для определения продуктивности каждого

1 клона после завершения процесса культивирования. В процессе культивирования из каждой пробы отбирают на 2-3

1 сутки культивирования по 5-10 мл суспензии вегетативной культуры и хранят в холодильнике до окончания процесса ферментации. После определения продуктивности каждого клона выявляют наиболее продуктивный клон и 2-3-суточную культуру этого клона, хранящуюся в холодильнике, используют для наработки посевного материала, 2-3-су- 5 точную культуру наиболее продуктивного клона высевают в жидкую питательную среду. Обычно посев проводят в колбы объемом 750 мл, заполненные 100 мл питательной среды, Полученный 2-3-суточный биологический материал используют в качестве посевного материала для засева колб большего объема и в большем числе, Могут быть использованы, например, колбы объемом 3000 мл, заполненные

400 мл питательной среды. Культивирование проводят в то же время, т.е„

2.-3- суток.

Выращивание эталонной культуры на плотной среде

Выращивание отдельных клонов на плотной среде

8-12 8-12

8-12

Процесс размножения посевного материала повторяют до тех пор, пока не будет наработано необходимое количество посевного материала, которое зависит от применяемого ферментационного оборудования. При этом кратность пересевов и разовые объемы фермента-

;ионной среды могут быть изменены, о в любом случае требуется,.чтобы размножение посевного материала проводилось только в жидкой питательной среде.

Кроме того, в соответствии с предлагаемым способом размножение культуры осуществляют пересевом 2-3-суточной культуры, в то время как известный способ предусматривает пересевы

8-1 2-суточной культуры, Преимущества предлагаемого способа состоят в том, что значительно сокращается время наработки посевного материала, необходимого для засева промышленного аппарата. Например, для засева промышленного аппарата объемом 63 м, требуется 3-4 м по3 севного материала, Для наработки такого его количества обычно требуется не менее 10 косяков посевной культуры, полученных с эталонного образца.

Как правило,для наращивания 10 косяков осуществляют первоначальный засев эталонной культурой 4-5 косяков, а затем на втором этапе с первичных косяков проводят засев еще 6-8 косяков. Общая продолжительность процесса размножения только первичного материала составляет таким образом 16-;

24 суток, а всего для приготовления требуемого количества посевного мате. риала затрачивается 59 75 суток.

Для наработки этого же количества посевного материала по предлагаемому способу необходимо лишь 25-29 суток исходя.из расчета, приведенного в табл,2.

Т б аблица 2 операции

Проверка продуктивности клонов

Размножение клонов на косяках (первый этап)

Размножение клонов на косяках (второй этап)

Выборочная проверка продуктивности

Наработка посев8-1 2

Стабильность продуцирующей активности биоматериала, получаемого пред20 лагаемым способом, показана в табл. 3.

Таблица3

5 5412

Продолжение табл.2

Длительность, сут, по способу

5 извест- предланому гаемому

8-1 2

58 6 словами от единичного эталонного об разца может быть по предлагаемому способу получено больше качественного посевного материала, чем из единичного эталонного образца при использовании известного способа.

Крайне важным обстоятельством при этом является то, что размножаемый с эталонного образца посевной материал, получаемый известным способом, теряет активность, а полученный по предлагаемому способу ее не теряет.

Потеря продуктивности посевного материала, получаемого известным способом, показана в табл.1. ног о мат ериал а в колбах

Наработка посевного материала в инокуляторе

Наработка посевного материала в посевном ап2 2

59-75 25-29 парате

Всего

Описан вариант реализации предлагаемого способа, начинающийся с эталонной культуры, Однако в процессе промышленного производства возможно сокращение времени, необходимого для получения требуемого количества посевного материала. Так, например, выросшая из отобранного клона первичная суспензия (2-3-суточная суспензия вегетаТивного материала) имеет объем порядка 5-10 мл и может быть использована для засева 10-20 колб с объемом питательной среды 100 мл каждая, Часть полученного материала может использоваться для дальнейшего наращивания количества посевного материала, а часть может быть сохранена для использования в следующем промышленном процессе,, Кроме того, первичный посевной . материал,. выращенный на основе отобранного наиболее продуктивного клона, может быть размножен и при этом необ- ходимость использования эталонного материала может быть сокращена. Иными

Образование тилозина, ед/мл, при ко25 личестве пересевов !

3400 4000

Культура S . ГгаЫае 165 выращива-.

/ ется на среде состава, мас.7.: рыбная мука 2,0; меласса свеклосахарная

2,0; крахмал 1,5, диаммонийфосфат

0 02; . натрий хлористый 0,2; магний

35 серно-кислый 0,2; кальций углекислый

0,5; масло соевое 3,0; вода остальное.

В качестве исходной взята культура, выделенная из единичного клона с соответствующей продуктивностью.

Продуктивность определяется на 9 сутки культивирования. В качестве посев45 ной дозы на каждый последующий посев расходуется не более 10Х культуры предыдущего пассажа. Выращивание осуществляют в колбах объемом 750 мл, содержащих 100 мл среды. Только исход50 ная культура выращена в колбе объемом 300 мл с 30 мл среды.

Установлено, что при хранении первичной культуры, выращенной иэ единичного, эталонного клона, ее продуктивность практически не снижается при сроке хранения до 90 суток (время наблюде ний) при температуре от 0 до +2 r., что показано в табл.4.

1541258

Таблица4

Образование тилозина, ед/мл, при сроке хранения, сут

Кмкость

2 30 90

Колбы ,50 мл ферментер

«в7 л

4500 4250

4900 4700

Не определяется

Выращивание во всех случаях проодится на среде, содержашей, мас.%: м ука рыбная 2,0; меласса свеклосахарная 2,0; крахмал 1,5; диаммоний< осфат 0,02; натрий хлористый 0,2; магний серно-кислый 0,2; кальций углекислый 0,5, масло соевое 3,0; ода остальное.

II р и м е р 1. Эталонную споровую 25

4успензпю культуры S, fradiae 165

Высевают в чашки Петри на плотную

Среду, содержащую, мас.%: соевая мука 0,5; меласса свеклосахарная 0,5; кукурузпый экстракт 0Ä5", крахмал О;5; аммоний серно-кислый 0,1; натрий хлористый 0,1; магний серно-кислый (,05; кальций углекислый 0,2; агар ,5; вода остальное. Засеянные чашки омещают B термостат и выдерживают цри 28 С в течение 10 сут. о „

Для дальнейшего анализа отбирают

9 выросших колоний с типичными морфологическими признаками, Каждую из

Ф этих колоний переносят в отдельную 40 колбу объемом 350 мл, заполненную

30 мл среды состава, мас,%: мука рыбная 2,0; меласса свеклосахарная 2,0; крахмал 1„5; диаммонийфосфат 0,02; натрий хлористый 0,2; магний сернокислый 0,2; кальций углекислый

0,5, масло соевое 3,0, вода остальное, Колбы помещают на качалку и культивирование осуществляют при 28 С. о

Через 70 ч культивирования из каждой колбы стерильно отбирают по 5 мл суспензии, которую помещают в холодильник с температурой 2 С. Засеянные колбы культивируют на качалке в течение еще 6 суток. После завершения культивирования (т.е ° через 9 суток) в культуральной жидкости методом диф- . фузии в агар определяют достигнутую концентрацию тилозина. Наибольшая концентрация тилозина 4500 ед/мл достигнута в колбе Ф 5.

Из холодильника изымают 70-часовую пробу культуральной жидкости из кол" бы Р 5, которую в дальнейшем используют в качестве посевного материала.

Этой суснензией в количестве 0,5% за- севают 10 колб объемом 750 мл, заполненных 100 мл,среды состава, мас.%: ! соевая мука 2,5„глюкоза 2,5; кукурузный экстракт 1,0; хлористый натрий 0,2; углекислый кальций 0,5, вода остальное, Засеянные колбы выдерживаются на качалке при 28 С в течение

2 суток. В результате получено 1000 мл посевного материала.

Полученным посевным материалом в количестве 100 мл засевают лабораторный ферментер объемом 1,7 л, заполненный 1,1 л среды, содержащей, мас.%: мука рыбная 2,0, меласса свеклосахарная 2,0; крахмал 1,5; диаммонийфосфат 0,02; натрий хлористый 0,2; магний серно-кислый 0,2; кальций углекислый 0,5; масло соевое 3,0; вода остальное. Выращивание в стандартных условиях при 28 С продолжается 211 ч.

Концентрация тилозина в культуральной жидкости составляет 4900 ед/мл.

В качестве посевного материала используют первичный биоматериал, выращенный из единичного эталонного образца, размноженный до объема в

1ОО мл в один этап. Посевная доза составляет 10%. Продуктивность опре.— . деляется на 9 сутки ферментации.

Таким образом, уровень антибиотикообразования в лабораторном процессе находится на уровне продуктивности эталонной культуры.

П р и и е р 2. Эталонную споровую суснензию культуры S, fradiae Б-45 используют для приготовления посевного материала в условиях примера 1.

В качестве исходного используют наиболее продуктивный клон У 13, выделенный на плотной среде, продуктивность которого составляет 2900 ед/мл, В лабораторном ферментере объемом

1,7 л накопление тилозина составляет 3100 ед/мл.

Таким образом, использование пред" лагаемого способа по . сравнению с известным позволяет сохранить продуктивность посевного материала на уровне активности эталонной культу1258 l0 сез fradiae путем посева исходной культуры на плотную среду с последующим пассированием на питательных средах, отличающийся тем, что, с целью снижения потери активности, с плотной среды отбирают клон и пассирование его проводят на жидких питательных средах.

154 ры и при этом значительно сократить время, необходимое для приготовления посевного материала. формула и з обретения

Способ подготовки посевного материала продуцента тилозина StreptomyСоставитель Н. Афанасьева

Редактор И, Горная Техред М.Ходанич Корректор 0. Кравцова

Заказ 264 Тираж 482 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101