Способ определения гликозаминогликанов в жидких средах

 

Изобретение относится к биологической химии. Цель изобретения - упрощение способа за счет сокращения числа трудоемких операций при одновременном уменьшении объема исследуемой пробы. Способ основан на способности гликозаминогликанов взаимодействовать с положительно заряженным флуорокрасителем - акридиновым оранжевым. Смесь акридинового оранжевого и исследуемой жидкости вносят в лунку в агарозном геле, содержащем гепарин, и после ее диффузии в гель измеряют диаметр кольца преципитации, образующегося при взаимодействии гепарина с избытком акридинового оранжевого, не связавшегося с гликозаминогликанами исследуемой жидкости. При этом диаметр кольца преципитации обратно пропорционален концентрации гликозаминогликанов в исследуемой жидкости. Способ позволяет просто и быстро (в течение 5 ч) определять концентрацию гликозаминогликанов в большом количестве образцов и может быть широко использован в клинической биохимии, при проведении массовых обследований вне специализированной биохимической лаборатории, в медицинской промышленности для контроля производственных этапов при получении лекарственных препаратов, содержащих гликозаминогликаны, и экспериментальных работах. 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) 5 G 01 N 33/48 33/с59

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4332675/28-14 (22) 24. 1 1 . 87 (46) 23.02.90. Бюл. 1!1 7 (71) Филиал Института медицинской генетики АИН СССР (72) С.П. Фещенко и Н.Н. Былинский (53) 612 ° 015(088,8) (56) Горняк Л.Л. и др. — Вопросы медицинской химии.-1986, т. 32, вып.5, с, 48-52. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛИКОЗАИИНОГЛИКАНОВ В ЖИДКИХ СРЕДАХ (57) Изобретение относится к биологической химии ° Цель изобретенияупрощение способа эа счет сокращения числа трудоемких операций при одно-.. временном уменьшении объема исследуемой пробы. Способ основан на способности гликозаминогликанов взаимодействовать с положительно заряженным флуорокрасителем — акридиновым оранжевым. Смесь акридинового оранжевого и исследуемой жидкости вносят в лунку

Изобретение относится к биологической химии, а именно к количественному определению гликозаминогликанов (ГАГ), и может быть использовано в клинико-лабораторных и экспериментальных исследованиях.

Цель изобретения — упрощение способа за счет сокращения числа трудоемких операций при одновременном уменьшении объема исследуемой пробы.

Способ осуществляется следующим .. образ ом.

В кипящей водяной бане расплавляют

16 мл 1,57-ной агарозы. в 0,15 М раст„„SU„„1545161 А 1

2 в агарозном геле, содержащем гепарин, и после ее диффузии в гель измеряют диаметр кольца преципитации, образующегося при взаимодействии гепарина с избытком акридинового оранжевого, не связавшегося с гликозаминогликанами исследуемой жидкости. При этом диа-. метр кольца преципитации обратно пропорционален концентрации гликозаминогликанов в исследуемой жидкости. Способ позволяет просто и быстро (в течение 5 ч) определять концентрацию, гликоэаминогликанов в большом количестве образцов и может быть широко использован...в клинической биохимии, при проведении массовых обследований вне специализированной биохимической лаборатории, в медицинской промышленности для контроля производственных этапов при получении лекарственных препаратов, содержащих гликоэаминогликаны, и экспериментальных работах. 4 табл. воре хлористого натрия, добавляют

25 ЕД (1 ЕД=0,0077 мг) гепарина в

0,15 M растворе хлористого натрия и после интенсивного перемешивания заливают агарозу в пластиковую чашку

Петри с диаметром 10 см, находящуюся в строго горизонтальном положении ° После застывания агароэы с помощью подложенного под чашку трафарета вырезают в геле лунки диаметром 3 мм и с расстоянием между лунками и между крайними лунками и бортиком чашки не менее 1 см. Затем в ячейках планшета для иммунологических реакций

1545161

1 либо пробирках для микропроб смешивают по 10 мкл 0,05%-ного водного раствора акридинового оранжевого (АО) и по 10 мкл исследуемой жидкости. Смесь инкубируют 20 мин и пе-...:

5 реносят микрошприцем или автоматической пипеткой по 15 мкл смеси в лунки в агароэном геле. Чашку Петри закрывают и оставляют на 4 ч при комнатной 10 ( температуре. За это время не связанный ГАГ исследуемой жидкости избыток +0 диффундирует в гель и формирует с гепарином видимое копьцо преципита ции. Для измерения диаметра KoJIbIJB спользуют конусную линейку, изготовленную из масштабной бумаги„ Ко нусная линейка располагается под

) дном чашки Петри и кольцо преципита ции совмещается с соответствующим ее диаметру участком конуса, Концентра ию ГАГ определяют по калибровочной ривой, построенной в координатах

) диаметр кольца преципитации (мм)/

/концентрация ГАГ в стандартных раст- 25

bopax (мг/мл), В качестве стандартных растворов ГАГ используют растворы хондроитинсульфата в 0,15 M растворе хлористого натрия в пределах концентраций 0,05 — 0,3 мг/мл. При 30 этом диаметр кольца преципитации изМеняется соответственно от б,9".0,1 мм до 5, О+0,1 мм (нижняя граница чувстительности 0,5 мгк ГАГ). Повышение онцентрации гепарина и/или АО позоляет, при необходимости, получать алибровочные кривые для определения онцентрации ГАГ в более высоких концентрационных пределах, Наличие в исследуемой жидкости белка. в концентрации 4 мг/мл не препятствует взаимодействию ГАГ и AO °

Пример 1, Построение калибровочной кривой для стандартных

45 растворов ГАГ.

Для построения калибровочной кривой готовят 1 мл 0,05%-ного водного раствора АО и по 1 мл стандартных растворов хондроитинсульфата (ХС) в концентрации 0,05; 0,10; 0,20;

0,30 мг на 1 мл 0,15 M раствора хлористого натрия. В ячейках планшета для иммунологических реакций смешивают по 10 мкл стандартного раствора XC u 10 мкл раствора АО . Яо

15 мкл смеси переносят в лунки в агарозном геле и через 4 ч производят измерение диаметров колец преципитации. Результаты измерения представлены в табл, 1, Пример 2, Определение суммарного содержания ГАГ в растворе протеогликанов (ПГ).

Для определения вносят в ячейку планшета, содержащую 10 мкл 0,05%-ного раствора АО, 10 мкл раствора ПГ в концентрации 0,2 мг на 1 мл 0,15 М раствора хлористого натрия. 15 мкл смеси переносят в лунку в агарозном геле, через 4 ч измеряют диаметр кольца преципитации и по калибровочной кривой (пример 1) находят соответствующую концентрацию ГАГ, Результаты измерения для двух препаратов

ПГ приведены в табл. 2 и свидетельствуют о том, что содержание ГАГ в исследуемых препаратах составляет

90 и 85% от общего содержания ПГ в растворах.

Пример 3. Оценка специфичности взаимодействия АО с ГАГ.

Для исключения возможного влияния белков на взаимодействие АО с ГАГ используют сыворотку здоровых доноров (n=4), в которой концентрация

ГАГ(0,05 Mr/мл. Результаты измерения диаметра колец преципитации, образовавшихся при отсутствии сыворотки и при ее добавлении, представлены в табл, 3 и свидетельствуют, что при— сутствие белка не влияет на взаимосвязь АО с ГАГ, так как диаметры образовавшихся колец зависят в данной серии экспериментов лишь от содержания ГАГ в пробах, Пример 4, Определение концентрации ГАГ в моче больных ортопедического стационара с целью выявления гигерэкскреции ГАГ, Для выявления повышенной концентрации ГАГ в моче пригодна калибровочная кривая, приведенная в примере 1.

Нормальный уровень экскреции ГАГ менее 0,14 мг/мл, все более высокие значения могут указывать на нарушение метаболизма ГАГ. Для таких больных необходимы, дополнительные клиниколабораторные обследования в специаль— ных биохимических лабораториях, Для определения берут 0,05%-ный водный раствор АО (необходимый объем реагента определяется числом обследуемых больных из расчета 10 мкл АО на одно определение), Вносят по 10 мкл раствора .АО в лунки планшета для

5 154 иммунологических реакций. Затем микрошприцем добавляют в каждую лунку по 10 мкл мочи обследуемых пациентов.

Для шифровки образцов мочи используют цифры 1-12 (по горизонтали) и буквы А-Н (по вертикали), имеющиеся на бортиках планшета (пример шифров

А-I, А-5, В-IО, С вЂ” 12 и т.д.). Через

4 ч после переноса 15 мкл каждой смеси в лунки в агарозном геле измеряют диаметры колец преципитации. Затем по калибровочной кривой определяют концентрацию ГАГ и выявляют больных, имеющих концентрацию ГАГ больше

0,14 мг/мл (табл. 4). Для точного определения концентрации ГАГ, превышающей 0,3 мг/мл, проводят повторное определение путем добавления двух объемов АО (20 мкл) и к 10 мкл мочи (необходимость повторного определения при очень высоком содержании ГАГ в пробах возникает и при иснользовании,известных способов. Приведенной в примере 1 калибровочной кривой в принципе достаточно для выявления больных с патологической концентрацией ГАГ (0,14 мг/мл). В табл. 4 это больные А-I, А-4, А-5, А-б, В-3 В-9, С-3, С-4. В данную группу попали все больные с мукополисахаридозами — заболеваниями, связанными с нарушениями деградации ГАГ, при которых наблюдается повышенная экскреция

ГАГ с мочой. !

Отличием предлагаемого способа явля етс я техническая прос тота выполняемых операций, сокращение времени проведения большого числа определений, возможность использования микропроб тестируемых жидкостей. Упрощение способа состоит в том, что для определения не требуется дорогостоящее оборудование, устраняется ряд трудоемких операций — например, диалиэ проб, При наличии предварительНо залитых агароэой чашек. Петри возможно проведение массовых обследований определенных групп населения в экспедиционных и полевых условиях, например, при выявлении больных с мукополисахаридозами в специализирован.—

5 I 6! 6 ных медицинских учреждениях. Даже при наличии только одцой чашки Петри диаметром 10 мм (42 лунки) можно ис—

5, следовать 34 пробы и построить калибровочную кривую по 4 точкам в дублях.

Предлагаемый способ сокращает время определения — это примерно 5 ч с момента получения проб до момента определения в них концентрации ГАГ. Известный способ требует более суток (пробы предварительно диализуют в те- чение нОчи), Для определения концентрации ГАГ предлагаемым способом необходимо не более 40-50 мкл исследуемой жидкости, для известного способа— не менее 200 мкл (в связи со сложностями при проведении диалиэа меньшего количества жидкости).

20 Способ позволяет просто, быстро и с использованием меньшего количества исследуемой жидкости определять концентрацию ГАГ в больших сериях образцов. Способ может быть широко

25 использован в клинической биохимии, при приведении массовых обследований вне специализированной биохимической лаборатории, в медицинской промышленности для контроля производственных

30 этапов при получении лекарственных препаратов, содержащих ГАГ (гепарина, хонсурида и др.) и в экспериментальных работах, ФоРмУлаиз обре тения

Способ определения гликозаминогликанов в жидких средах, включающий обработку исследуемой пробы красителем, 10отличающийся тем,что, с целью упрощения способа эа счет сокращения числа трудоемких .операций при одновременном уменьшении объема исследуемой пробы, к пробе добавляют

45 акридиновый оранжевый, смесь вносят в лунку в агарозном геле, содержащем гепарин, инкубируют, затем измеряют диаметр образовавшс".гася кольца преципитации и определяют концентрацию

50 гликозаминогликанов, которая находится в обратно пропорциональной зависимости от диаметра кольца преципитации.

1545161

Та блица 1

Объем раствора ХС, вноОбъем смеОбъ ем

Концентрация ХС, мг/мл

Диаметр кольца преципитации, мм си, переносимой в симого в ячейку планшета, лунку в агаровном геле, мкл

Та блица 2

1 кспеимент

КонПроцентное соОбъем

Диаметр кольца преципитации, мм

Объем

Объем центрация ГАГ, мг/мл смеси, переносимой в держание

ГАГ в пробах ПГ, % лунку, 0,18 90

О, 16-. 85

5,9

6,1

l0

0,2

0,2

1

Таблица 3

Диаметр кольца преципитации, мм

Расчетная

Объем

Эксперимент

Объемы реагентов, вносимых в ячейку планшета, мкл концентрация ХС, мг/мл смеси, переносимой в сыворот- А0 ХС ка лунку, мкл

10 5 0,2 15

10 10 0,1 15

10 5 0,8 15

10 10 0,4 15

6,2

6,2

4,9

4,9

2

0,05

0,10

0,20

0,30

Концентрация раствора

ПГ, мг/мл

10 рас твора

ПГ, вносимого в ячейку. планшета, мкл раствора

АО, в но; симого в ячейку планшета

10 раствора

АО, вносимого в ячейку планшет а „ мкл

Концентрация стандартного рас твора

ХС, мг/мл

6,9

6,5

5,8

5,0

0,1

О,!

0,4

0,4

1 545161

Таблица 4

Множественная эпифизар-... ная дисплазия

Здорова, мать больного

А-1

Псевдоахондроплаэия

Мукополисахаридоэ, тип VI

Мукополисахаридоз7

Мукополисахаридоз, тип II

Здорова, мать больного

А-6

Системное заболевание

8 лет

0,24

5,5

35 лет (.О, 05

7,3

А-2 (0 05

0,28

8 лет

5 лет

Н

7,3

5,2

А-3

А-4

6,0

4,8

4 г. 3 мес.

3 года

0, l8

) 0,30

А-5

А-6 (О, 05 (О, 05

35 лет

7,6

А-7

8 лет

7,2

А-8 скелета

Спондилоэпифизарная дисплазия

Псевдоахондроплазия

Здорова, мать больного

А — 10

Меэомелическая карликовость

Псевдоахондроплазия

Здоров, брат больного

В-l

ll лет

О, 12

6,4

10 лет

30 лет

Н

О, ll (0,05

6,5

А-1 О

А-11 (,0,05

12 лет

7,8

А-12

8 лет

3 года

Н

Н (0,05

0,07

7,3

6,8

В-1

В-2. Синдром Ларсена

2 r. 10 мес

9 лет

36 лет

П

Н

0,15 (0,05 (О, 05

6,2

7,9

7,0

В- 3

В-4

В-5

Псевдоахондоплазия

Здоров, отец больного .

В-4

Псевдоахондроплаэия

Спондилоэпифизарная дисплазия

Контрактура Дюпюитрена

Мукополисахаридоз, тип l

Здорова, мать больной

В-9

Здоров, отец больной

В-9

Множественная эпифизарная дисплазия .Здоров, брат больного

В-12

Здоров, брат больного

С-3

Хондродистрофия МакКьюсик а

20 лет

16 лет

Н

Н (0,05

«О 05

7,4

7,0

В-6

В-7

29 лет

4 года

30 лет

Н

П

Н (0,05

0,14

0,08

7,3

6,3

6,7

В-8

В-9

В-l О

39 лет

О, 08

6,7

В-11

5 лет

Н (О, 05 (О, 05 (0,05

7,0

В-12

3 года

10 лет

6 лет

7,0

7,2

С-2

0,19

5,9

С-3

1545161

Продолжение табл.4

5,0 >0,.3

6,4 0,12

С-4

С-5

5 лет

10 лет

П н

Мукополисахаридоз тщп l

Метаэпифизарная дисплазия

Ганглиозидоз .

Псевдоахондроплазия

6,5 0,11

6,7 0,08

3 r. 5 мес.

4 r. 4 мес.

Составитель Н, Гуляев

Редактор Е. Папп Техред Л.Олийнык Корректор О. Ципле

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

Заказ 488 Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

1 13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5