Способ оценки повреждающего действия веществ, контактирующих с роговицей

 

Изобретение относится к области медицины - офтальмологии и может быть использовано при исследовании новых ирригационных и влагозамещающих растворов, а также изучении биологических свойств полимеров, используемых для интраокулярной и контактной коррекции. Цель изобретения - повышение точности способа за счет увеличения его физиологичности. Способ состоит в инкубации препарата роговицы с исследуемым веществом и регистрации скорости окисления восстановленных пиридиновых нуклеотидов (НАДН или НАДФ Н), добавленных в среду инкубации. Скорость окисления регистрируют флюорометрически или спектрофотометрически, и по ее величине оценивают степень повреждающего действия вещества. Способ позволяет исследовать биологическое действие на роговицу материалов и препаратов, используемых в фармакологии.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧНКИХ

РЕСПУБЛИК

1617377 А1 (19) (И) щ)g G-О1 К 33/52

ПРИ ГННТ СССР, Ф

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТРЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬ)ТИЯМ

Н А ВТОРСКОЬГФ СОИДЕТЕЛЬСТВУ

1. (21) 4383190/30-14 (22) 24.02.88 . (46) 30.12,90. Вюл. М 48 (71) Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца (72) М. А. Бабижаев, А.Г. Травкин, А.И. Толчинская, И.Э. Иошин и Э.В. Егорова (53) 612.015(088.8) (56) Gundoiova R.À., Travkin А.G.

Klin. МЬе; Augen1ieilk, 1978, В. 173, .S. 482. (54) СПОСОВ ОЦЕНКИ ПОВРЕЖДАЬЦЕГО ДЕЙСТВИЯ ВЕЩЕСТВ, КОНТАКТИРУЮЩИХ С РОГОВИЦЕЙ . (57) Изобретение относится к области медицины — офтальмологии и может быть использовано при исследовании новых

Изобретение относится к офтальмо,логии и может быть применено при исследовании новых ирригационных и влагозамещающих растворов, а также изучении биологических свойств полимеров, используемых для интраокулярной и

-контактной коррекции.

Цель изобретения — увеличение точности способа за счет повышения его физиологичности, Способ осуществляется следующим образом.

Используют роговицу кроликов сам. цов породы шиншилла весом в среднем

2,0 кг. После забоя животных глаза: сразу же энуклеируют, а затем из глаз ирригационных и влагоэамещающих растворов, а также изучении биологических свойств полимеров, используемых для интраокулярной и контактной коррекции. Цель изобрете)(ия — повышение точности способа за счет увеличения его физиологичности. Способ состоит в инкубации препарата роговицы с исследуемым веществом и регистрации скорости окисления восстановленных пиридиновых нуклеотидов (НАДН или

НАДФН), добавленных в среду инкубации. Скорость окисления регистрируют флюорометрически или спектрофотометрически, и по ее величине оценивают степень повреждающего. действия вещества. Способ позволяет исследовать биологическое действие на роговицу материалов и препаратов, используемых в фармакологии. вьщеляют с помощью трепана центральный диск роговицы диаметром 7,7 мм.

Роговичный диск помещают на дно инкубационной кюветы эндотепием вверх в среду, содержащую 2,0-3,0 мл 0,9%"ного физиологического (Na01) или исследуемого влагозамещающего раствора, содержащего тестируемый агент. Процедура вьщеления роговицы занимает 815 мин с момента забоя животного до получения готового исследуемого образца. Инкубацпю роговицы проводят при комнатной температуре. Поддерживают нейтральный 7 0-7,3 показатель рН среды. Кинетику окисления экзогенных пиридиновых нуклеотинов (НАДН

1617377,или НАРФН), добавленных в среду с момента начала инкубации роговицы в концентрации 5 ° 10 И, измеряют флюоресцентным способом (возбуждение при

Зб0 нм, регистрация при длине волны максимума испускания 460 нм), Все флюоресцентные измерения выполняют на спектрофлюориметре, Для снижения влияния возможных оптических артефактов флюоресценцию возбуждают узким пучком вета (1-3 мм), направленным вдоль йередней (обращенной к регистрирую,щему монохроматору) стенки кварцевой кюветы. По увеличению скорости оки.сления пиридиновых нуклеотидов (скорости спада интенсивности фпюоресценции) судят о степени повреждения роГовицы. 3а скоростью окисления нуклеотидов можно следить и спектрофотомет- 20, рически при 340 нм.

Пример 1.. Проводили исследоВание поверждающего действия на рогоВицу 0,9Х-ного физиологического растВора, 25

Роговицу кролика выделили из глаза. При помещении роговицы кролика в 0,97-ный физиологический раствор в течение первых 10 мин увеличивалась интенсивность флюоресценции раствора. 30

В том случае, если роговица после извлечения из глаза предварительно инкубировалась в течение 20 мин в физиологическом растворе, не содержащем НАДН, в результате ее значительного повреждения к этому времени в окружающей среде накапливались вещества, ооладающие НАДН-дегидрогенаэной активностью, Добавка пиридинового нуклеотида на 20 мин инкубации ткани 40 немедленно приводила к увеличению.

НАДН-окислительной активности роговицы и одновременному снижению интенсивности исходного уровня флюоресценции. Указанная экспериментальная кинетика окисления НАДН полностью соответствует ожидаемой. Пример 2. Исследование действия ра роговицу сбалансированного солевого раствора.

При инкубации изолированной роговицы кролика в среде, содержащей сбалансированный солевой раствор, и добавленйи пиридиновых нуклеотидов отмечался менее выраженный двухфазный характер изменения интенсивности флюоресценции раствора, Таким образом, сбалансированный солевой раствор ограничивает осмотическое повреждение ткани роговицы.

Пример 3, Исследование действия на роговицу влагозамещающего раствора — таурина (тауфона), Известно, что указанный раствор (0,057, рН 7,2) благоприятно влияет на процессы регенерации при повреждении задных слоев роговицы с формированием тонкого рубца, Данные, полученные при помещении изолированной роговицы кролика в раствор тауфона, свидетельствовали о предотвращении повреждения мембран клеток роговицы.

Указанный эффект проявлялся в равной степени и на снижении уровня выхода флюоресцирующих субстратов из ткани роговицы, и на снижении их НАДН-окислительной активности.

Пример 4. Исследование действия на роговицу карнозина (f3аланил-1-гистидина), 10 мМ раствора, рН 7,2-7,3.

Установлено, что репаративные процессы в тканях, транспорт ионов

Са +, Na+, К+ и реакции окислительного фосфорилирования после предварительного их нарушения, вызванного повреждающнми воздействия, протекали на более благоприятном уровне в присутствии гистидиновых депептидов в силу сохранения дипептидами физиологических свойств мембран и уменьшения утечки ионов. Целью исследования действия карнозина - природного соединения гистидиновых дипептидов, на нарушение барьерных свойств.мембранных структур клеток роговицы кролика было определение возможности использования карнозина в клинике как влагозамещающего раствора, В присутст:вии карнозина (10 мМ) сравнительно с физиологическим раствором отмечался существенный защитный эффект на ранних стадиях повреждения клеточных структур роговицы. Об этом свидетельствуют незначительные изменения флю" оресценции экзогенного НАДН (т.,е ° наличие малой скорости его окисления), присутствующего в среде инкубации роговицы.

Таким образом,карнозин можно рекомендовать для дальнейших испытаний как вещество„ защищающее роговицу от новреждающих воздействий и перспективное для апробации в клинике в виде влагозамещающего раствора;

Составитель Н. Гуляева

Редактор Л. Пчолинская Техред Л.Сердюкова

Корректор М, Максимишинец

5аказ 4117 Тираж 511 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óêãîðîä, ул. Гагарина, 101

16173

Пример 5. Изолированную ткань роговицы, инкубировали в растворе

Н О (10 М), содержащем НАДФН (5 х10 М) сбалансированный раствор Хэнкса, Кинетику окисления НАДФН регистри- 5 ровали по снижению оптической плотности поглощения при длине волны 340 нм на спектрофотометре Shimadpц UV-260.

Через 15-20 мин инкубации отмечали

10 значительный спад поглощения (от

0,80 и 0.68) отбираемых проб инкубационной среды. Снижение величины оптической плотности при 340 нм раствора, содержащего НАДФН, свидетельствовало

I5 об освобождении водорастворимых ферментов (например, глутатион-редуктазы), обладающих НАДФГ-дегидрогеназной активностью, из ткани роговицы.

Предлагаемый способ позволяет по 20 сравнению с прототипом повысить точность способа sa счет повышения его физиологичности.

Применение способа обеспечивает метаболический контроль роговицы 25 на ранних этапах ее повреждения агентом, что позволяет повысить точность тестирования агента. Предлагаемый способ дает возможность изучать механизм, и последовательность биохимических реакций, приводящих к отеку роговицы и потере ее прозрач77 6 ности. Способ позволяет осуществлять выбор биологических соединений, способных защищать эндотелий роговицы от повреждения, указывать оптимальный состав ирригационных жидкостей и влагозамещающих растворов, изучать биологические свойства полимерных материалов, используемых в офтальмологии.

Прямое и продолжительное определение редокс-состояния НАДН в среде инкубации роговицы позволяет количественно судить об активности процессов, происходящих при токсических воздействиях на роговицу.

Формула изобретения

Способ оценки повреждающего действия веществ, контактирующих с роговицей, включающий добавление исследуемого вещества в срецу инкубации препарата изолированной роговицы и регистрацию окислчтельно-восстановительных реакций в среде инкубации, о т.л и ч а ю шийся тем, что, с целью увеличения точности способа за счет повышения его физиологиччости, в среду инкуоации дополнительно вводят раствор восстановленного пиридинового нуклеотида и регистрируют скорость его окисления, по которой оценивают степень поврежд4ющего действия.