Способ определения гидроперекисей липидов в крови

 

Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано в научных исследованиях. Цель изобретения - повышение точности способа. Способ заключается в обработке плазмы и эритроцитов антиоксидантом ионолом, треххлористым железом, тиобарбитуровой кислотой и додецилсульфатом натрия в 0,44 М солянокислом буфере PH 3,6. Проводят инкубацию в течение 30-60 мин при 90-92°С, затем экстрагируют окрашенное соединение смесью ледяной уксусной кислоты и хлороформа и определяют оптическую плотность при 532-534 нм. Способ обеспечивает повышение точности способа за счет образования стабильного окрашенного комплекса гидроперекисей с тиобарбитуровой кислотой.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (зол G 01 и 33/52,33/92

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ..

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4274417/30-14 (22) 01.07.87 (46) 30.10.90. Бюл. ЬЬ 40 (71) Харьковский научно-исследовательский институт терапии (72) Л.К. Бахова, С,А. Лазарева и T.Ê, Фадеева (53) 612,015(088.8) (56) Asakawa Т., Matsusklta S. Z!pids, 1980, ч.15, р.137-140, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИДРОПЕРЕКИСЕЙ ЛИПИДОВ В КРОВИ (57) Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано в наИзобретение относится к клинической биохимиии и может быть использовано в медико-биологических исследованиях.

Цель изобретения — повышение точности способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Берут 3 — 5 мл крови из вены в предварительно охлажденные флакончики, содержащие 3 — 5 капель 6% — ного раствора этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА), Отделяют плазму от эритроцитов путем центрифугиравания (при количестве оборотов, равном 1000 об./мин) в течение 5 мин, Проводят 3-кратную промывку эритроцитов охлажденным физиологическим раствором, разводят тем же раствором до получения

25 -ной суспензии.

Берут 0,5 плазмы крови и обрабатывают ее путем добавления 0,1 мл 1%-нога спиртового раствора антиоксиданта ионола, 0,1 мл 0,27%-ного спиртового раствора

„„Я2„„1603299 Al учных исследованиях, Цель изобретения— повышение точности способа. Способ заключается в обработке плазмы и эритроцитов антиоксидантом ионола, треххлористым железом, тиобарбитуровой кислотой и додецисульфатом натрия в 0,44 M солянокислом буфере рН 3,6. Проводят инкубацию в течение 30-60 мин при 90-92 С, затем экстрагируют окрашенное соединение смесью ледяной уксусной кислоты и хлороформа и определяют оптическу)а плотность при 532534 нм, Способ обеспечивает повышение точности за счет образования стабильного окрашенного комплекса гидроперекисей с тиобарбитуровой кислотой. греххлористого железа, 1,1 мл глицин-солянокислого буфера (1 М, рН = 3,6 мл тиобарбитуровой кислоты (ТБК) (500 мг/100 мл) я додецилсульфате натрия (300 мг/мл). Берут

0,1 мл 25%-ной суспензии эритроцитов и обрабатывают их путем добавления 0,1 мл

1%-ного спиртового раствора ионола, 0,1 мл

0,27%-ного раствора хлористого железа.

1,5 мл глицин-солянокислого буфера (рН =

3,6) и 1,5 мл ТБК, Приготавливают контрольную пробу для плазмы путем использования 0,5 Мп физиологического раствора и всех необходимых указанных компонентов. Приготавливают контрольную пробу для зритроцитов путем использования 0,1 мл физиологического раствора и всех указанных компонентов.

Инкубируют опытные и контрольные пробы в термобане при 90 — 92 С в течение

30 — 60 минут. Охлаждают опытные и контрольные пробы в ледяной бане. Проводят экстракцию гидроперекисей липидов в

1603299

Таблица1

Зависимость содержания гидроперекисей в плазме крови от режима инкубации (температурный режим) Примечания: = 10;

*- остальные условия определения: 0,1 мл плаэмы; использован 1 М глицин-солянокислый буфер конечная кон) центрация 0,44 м; инкубацию осуществляли в течение 60мин, ** —; Р< 0,05;

*** — сравнение с 3 группой; Р< 0,05. опытных пробах путем добавления 1 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл хлороформа в каждую пробу — опытную и контрольную.

Центрифугируют все пробы при

3000 об./мин в течение 10 мин. Отбирают верхний окрашенный слой для спектрофотометрическай оценки интенсивности окраски опытных проб. Определяют гидроперекиси. липидов по интенсивности окраски опытных проб относительно контрольных по величине оптической плотности Е при длине волны 532-535 нм на спектрофотометре типа СФ вЂ” 26.

Определяют в опытных пробах (в эритроцитах и плазме крови) содержание белка по Лоури. Рассчитывают содержание гидроперекисей липидов (ЗГП) для каждой опытной пробы, т.е. вэритроцитах и плазме, по формуле

ГП—

Б 156° - 10 . где ГП вЂ” содержание гидроперекисей липидов, нмоль/мг белка;

Š— величина оптической плотности;

Б — содержание белка в эритроцитах и плазме, мг/мл;

1,56 .10 . — молярный коэффициент экс-5 тинкции. В табл. 1 и 2 представлены данные конкретного эксперимента.

Из таблицы следует, что оптимальный режим инкубации 90 — 92 С, при нвм достигается увеличение интенсивности окраски на 43 и 47% соответственно.

Таким образом, продолжительность инкубации — существенный фактор при выбранном температурном режиме.

Для реализации предлагаемого способа

10 можно использовать эритроциты и плазму в количестве 0,05 — 0,1 мл.

Изобретение позволяет повысить точность исследования за счет создания оптимальных условий реакции гидроперекисей с

15 ТБК.

Формула изобретения

Способ определения гидроперекисей липидов в крови путем инкубации проб зритроцитов и плазмы в присутствии анти20 оксиданта, солей железа, додецилсульфата натрия, глицин-солянокислого буфера с последующей обработкой тиобарбитуровой кислотой, экстрагированием окрашенного продукта смесью уксусной кислоты и хлоро25 форма и спектрофотометрированием, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве антиоксиданта используют ионол, инкубацию проводят при

90-92 С в течение 30-60 мин при концент30 рации буфера 0,44 М.

1603299

Таблица2

Зависимость содержания гидропероксидов в плазме крови от времени инкубации

Примечания: от5до10;

* — инкубационная смесь кроме прочих ингредиентов содержит 0,1 мл плазмы и 1,5 мл 1 М глицин-солянокислого буфера; температурный режим -90 С;

** — Р< 0,001. !

Составитель Н.Гуляева

Редактор И.Касарда Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор И.Муска

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 3382 Тираж 528 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5