Способ выделения микросом из ткани желудка экспериментального животного

 

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для выделения микросом из ткани желудка животных. Цель изобретения - повышение физиологичности способа за счет сохранения активности цитохрома Р450 и монооксигеназной ферментной системы желудка. Животному непосредственно перед забоем вводят в желудок раствор натрия гидрокарбоната . Затем животное забивают декапитацией. Быстро извлекают желудок, отсекают пищевод и 12-перстную кишку. В отверстие пищевода шприцем с канюлей вводят среду выделения, содержащую 50 ед/мл контрикала и 3 ед/мл гепарина с рН 7,8. После этого желудок вскрывают, измельчают ножницами и гомогенизируют в среде выделения, состоящей из 50 ед/мл контрикала , 3 ед/мл гепарина в 0,05 М трис(20% глицерин в 1,15% КС)буферес рН 7,8, затем гомогенат центрифугируют на ультрацентрифуге при 9000 g 20 мин , надосадок повторно центрифугируют при 105000д 60 мин. Полученный осадок микросом ресуспензируют в среде, состоящей из 0,05 М трис(20% глицерин в 1,15% КС)буфера рН 7,8, после чего спектрофотометрически определяют содержание цитохрома Р450 в микросомах желудка. 1 табл. ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4646396/14 (22) 03.02,89 (46) 30.01.91, Бюл. 1Ф 4 (71) Ташкентский государственный медицинский институт (72) А.С. Комарин. М.Э. Краковский. P.Ó. Худайбергенов и А.Х. Аширметов (53) 612.015(088,8) (56) Biochem. Pharmacol, 1985, ч. 34, hh 5, р. 599-608, (54) СПОСОБ ВЪ|ДЕЛЕНИЯ МИКРОСОМ ИЗ

ТКАНИ ЖЕЛУДКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЖИВОТНОГО (57) Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для выде, ления микросом иэ ткани желудка животных. Цель изобретения — повышение

I физиологичности способа за счет сохранения активности цитохрома Р450 и монооксигеназной ферментной системы желудка.

Животному непосредственно перед забоем

Изобретение относится к области биохимии и может найти применение при изучении монооксигеназной ферментной системы желудка.

Целью изобретения является повышение физиологичности способа эа счет сохранения активности цитохрома Р 450 в микросомах, Цель достигается тем, что животному перед декапитацией вводят через зонд в желудок 2 раствор гидрокарбоната натрия (йаНСОз) из расчета 1 мл на 100 г массы, а извлеченный желудок промывают средой, содержащей 50 ед/мл контрикала и

3 ед7мл гепарина, после чего дальнейшую

„„Я „„1 6243 18A1 вводят в желудок раствор натрия гидрокарбоната, Затем животное забивают декапитацией. Быстро извлекают желудок, отсекают пищевод и 12-перстную кишку. В отверстие пищевода шприцем с канюлей вводят среду выделения, содержащую 50 ед/мл контрикала и 3 ед/мл гепарина с рН 7,8.

После этого желудок вскрывают, измельчают ножницами и гомогенизируют в среде выделения, состоящей из 50 ед/мл контрикала, 3 ед/мл гепарина в 0,05 М трис(207 глицерин в 1,15 КС1)буфере с рН 7,8, затем гомогенат центрифугируют на ультрацентрифуге при 9000 g 20 мин, надосадок повторно центрифугируют при 105000g 60 мин, Полученный осадок микросом ресуспензируют в среде, состоящей иэ 0,05 М 3 трис(207; глицерин в 1,15;(КС1)буфера рН

7,8, после чего спектрофотометрически определяют содержание цитохрома Р450 в микросомах желудка, 1 табл. процедуру выделения микросом проводят по прототипу.

Способ осуществляется следующим образом.

Непосредственно перез забоем животному вводят в желудок через зонд 2 раствор натрия гидрокарбон эта из расчета

1 мл на 100 г массы тела, Затем животное забивают декапитацией, быстро извлекают желудок, отсекают пищевод и двенадцатиперстную кишку, в отверстие пищевода шприцем с канюлей вводят среду выделения, содержащую 50 ед/мл контрикала и

3 ед/мл гепарина рН 7,8, после чего желудок вскрывают, измельчают ножницами и гомогенизируют в среде выделения, состоящей

1624318

15

30 из 50 ед/мл контрикала, 3 ед/мл гепарина в

0,05 М трис-буфере (20 глицерина в 1,15Я

KCI) рН 7.8. Затем гомогенат центрифугируют на центрифуге при 9000 g 20 мин, надосадок повторно центрифугируют при

105000 g 60 мин, полученный осадок микросом ресуспензируют в среде, состоящей из

0,05 М трис-буфера (20 глицерин в 1,15

KCI) рН 7,8, после чего спектрофотометрически определяют содержание в микросомах желудка цитохрома Р 450.

Пример 1, Крыса-самец массой 200 г, За 5 мин до декапитации животному в желудок через зонд введено 2 мл 2 раствора натрия гидрокарбоната. После этого крыса декапитирована. Желудок извлечен, отделен от пищевода и 12-перстнай кишки. В просвет желудка введено 5 мл среды промывания, содержащей 50 ед/мл контрикала и

3 ед/мл гепарина, Желудок вскрыт, измельчен, гомогенизирован в среде, содержащей

50 ед/мл контрикала и 3 ед/мл гепарина, путем дифферен циал ьн ого центрифугирования выделена микросомальная фракция, в которой спектрофотометрически определено содержание цитохрома P 450, составившее 0,06 нмоль/мг белка, а также активность деметилазы амидопирина и

НАДФ-Н цитохром-с-редуктазы, составившие 0,147 нмоль НСОН/мг белка/мин и

12 нмоль/мг белка/мин соответственно.

Пример 2. Кролик-самец массой 4 кг.

3а 5 мин до декапитации животному в желудок через зонд введено 40 мл 2 раствора натрия гидрокарбоната. После этого кролик декапитирован. Желудок извлечен, отделен от пищевода и 12-перстной кишки, В просвет желудка введено 50 мл среды промывания, содержащей 50 ед/мл контрикала и

3 ед/мл гепарина. Далее процедура выделения микросом проведена по примеру 1, Содержание цитохрома P 450 0,101 нмоль/мг белка, а активность ферментов 0,403 нмоль

НСОН/мг/мин и 6,48 нмоль/мг/мин.

Пример 3. Морская свинка-самец 500 г массой. За 5 мин до декапитации животному в желудок через зонд введено 5 мл 2 раствора натрия гидрокарбоната, После этого животное декапитировано. Желудок выделен, в просвет введено 12 мл среды промывания, содержащей 50 ед/мл контрикала и

3 ед/мл гепарина. Далее процедура выделе35

50 ния микросом проведена по примеру 1.

Содержание цитохрома P 450 0,049 нмоль/мг белка, а активность ферментов 0,314 нмоль НСОН/мг/мин и 5,0 нмол ь/мгl мин.

В таблице приведены данные по активности ряд ферментов и содержанию цитохрома P 450 в желудках крыс, кроликов и морских свинок.

При выделении микросом желудка по прототипу содержание цитохрома P 450 не определяется, активность ферментов отсутствует.

Положительный эффект объясняется тем, что благодаря проведению нейтрализации соляной кислоты в желудке перед декапитацией животного и раннему блокированию протеолитических ферментов путем промывания органа до его измельчения и гомогенизации (в отличие от прототипа) средой выделения появляется возможность получить функционально полноценные микросомы желудка, обеспечивающие количественную характеристику цитохрома P 450 в желудке у животных, что в свою очередь позволяет исследовать монооксигеназную ферментную систему желудка при различных патологических состояниях с целью разработки вопросов патогенеза и оценки эффективности проводимой лекарственной терапии при пероральном приеме лекарств.

Формула изобретения

Способ выделения микросом из ткани желудка экспериментального животного путем декапитации животного, извлечения желудка, его измельчения и гомогенизации в среде выделения, отделения микросом дифференциальным центрифугированием, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения физиологичности способа, за счет сохранения активности цитохрома P 450 в микросомах, перед декапитацией животному вводят в желудок раствор гидрокарбоната натрия до нейтрального рН желудка, а перед измельчением желудок промывают средой, содержащей 50 ед/мл контрикала, 3 ед/мл гепарина, 0,05 М трис-буфер, 20 ный раствор глицерина и 1,15 -ный раствор хлорида калия рН 7,8.

1624318

Активность НАДФ-Н цитохром-се ктаэы нмоль мг мин

Цитохром Р 450. нмоль/Mf белка

Активность деметилазы амидопирина нмоль HCOH мг белка/мин к лики м. свинки м. свинки м. свинки к ысы к ысы. к лики к ысы к лики

6,54

6,5

5.15

4,97

6,7

5.2

5.3

5.7

6.3

4,9

0.197

0,403

0.296

0.395

0.249

0,190

0,415

0,392

0,390

0.281

0,078

0,101

0,095

0,096

0,087

0,106

0,085

0.056

0.087

0.112

0.090+

Ю.005

5,7+

М,22

0,321+, +О.028

Составитель А. Агуреев

Техред M. Моргентал Корректор С,Шекмар

Редактор О. Спесивых

Заказ 184 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

0,052

0,049

0.060

0,070

0.048

0.039

0,045

0,068

0,050

0,044

0.048

0.055

0.067

0.058

0.049

0.061

0.072

0.063

0.054

0,047

0.0552

М.002

0.049

0,065

0,051

0,062

0,047

0,059

0.065

0.072

0.058

0.061

0,078

0.055

0,049

0.047

0 058

0.061

0.043

0.041

0,052

0.058

0.056+

М.002

0,264

0.185

0,147

0,200

0.135

0.188

0,211

0,195

0.138

0,172

0,186

0.205

0,147

0,169

0,199

0.181

0.209

0,175

0,191

0,170

0.183+

Ю,007

0,314

0.252

0.300

0,198

0,245

0,321

0,189

0,252

0,195

0,229

0.335

0.296

0,285

0,272

0,305

0,198

0.185

0,213

0.244

0.190

0,251 и

+0,011

11 т

10,8

12,0 t 1.2

13,0 9,45

10.2

11.1

10,2

9.2

8.95

11,1

8.9

9,1

10,2

9.25

9,0

11,0

8.7

9.1

10.2 Ы,27

5,0

4,3

4,75

4,66

5.0

4,2

S,7

6.0

5.2

4,8

5,2

5,3

6,1

5.2

4,9

5.3

4,6

5,7

6.1

5.9

S.2й 0,13