Способ иммунодиагностики инфекций
Изобретение относился к области медицины и может быть использовано для ранней диагностики инфекций. Целыо изобретения является повышение точности диагностики. Цель достигается путем добавления исследуемой крови к специфическому и неспецифическому эритроцит арному предизрительно окрашенному диагностикуму с последующим определением фагоцитарной активности лейкоцитов крови н оценкой результатов реакции по соотношению показателей между специфическим и неспецифическим диагностикумами у больных и здоровых лиц. При соотношении показателей больше 1,5 и меньше 0,66 диагностируют инфекцию. Способ позволяем повысить точность диагностики дп 1007, в начале заболевания.
СОС3 СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
КСГМЛИК (51 ) 5 С 01 N 33/53
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ С8ИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМИ}
ПРИ ГКНТ СССР (2)) 3774)90>I 14 (22) 13.07.84 (46) 15 02,91 Бюп. У 6 (71) Пермский государственный м дицинский институт (72) В.Н. Каплии, Г,A. Клевцов», Н,А.))инина, Л.П.Санакоева и. В.П,Рочсв (53) 61 5 . 375 (088. 8 ) (56) Авторско; свидетельство СССР
Р 1492280. (54) СПОСОГ> )С >"-)УНОДИЛГНОСТИКИ ПНФЕКUHA (57) Изобретение относит ся к области медицины и может быть использовано для ранней диагностики инфекций, Изобретение относится к медицине и может быть использовано для р нней диагностики инфекций.
Цель изобретения — повышение точности способа, Способ осуществляют сл: дующим образом.
Для проведения диагностического исследования используют эритроциты из коммерческих антигенных эритроци" тарных диагностикумов для РПГА, а. при отсутствии готовых диагно>стику- мов применяют любой известный способ сенсибилизации антигеном формалинизированных или танизированных бараньих эритроцитов. В качестве контрольного (неспецифического) объекта фагоцитоза используют эритроциты, сенсибилизированные субстанцией микробов, не якеющей общих детерминант с субстан„„80„„1627 92 А1
Целью изобретения является повышение точности диагностики. Цель достигается путем добавления исследуемой крови к специфическому и неспецифическому эритроцитарному предварительно окрашенному диагностикуму с последующим определением фагоцитарной активности лейкоцитов крови и оценкой результатов реакции по соотношению показателей между специфическим и неспецифическим диагностикумами у больных и здоровых лиц. При соотношении показателей больше 1,5 и меньше 0,66 диагностиру1 т инфекцию. Способ поэволяет повысить точность диагностики до 1007, в начале заболевания, цией, которую содержат специфически сенсибнлизированные эритроциты, Желательно, чтобы оба вида микробов, субстанции которых используют для приготовления специфического и неспецифического объектов фагоцитоза, принадлежали к одному классу микроорганизмов, а сенсибилизированные эритроциты имели однотипную структуру поверхностных детерминант.
Один из видов эритроцитов окрашивают насыщенным водным раствором анилинового красителя черного или красного цвета, а другой вид — раствором красителя синего цвета, полученным разведением насыщенного раствора этой краски в )О раз. При окраске сухого ампулированного диагностикума в ампулу вносят 2 мп краски, тщательно встряхивают и выдержи1627992 вают в термостате не менее двух суток. Жидкий эритроцитарный диагиостикум смешивают с раствором краски в равных объемах и помещают в термо5 стат на 5 суток. Взвесь окрашенных эритроцитов отмывают от краски до исчезновения ее следов в нацосадочной жидкости. Кратковременным це н грифугированием или отстаиванием взвесь освобождают от конгломератов клеток.
В камере Горяева подсчитывают содержание эритроцитов во взвеси и pasaoдят ее физраствором до концентрации
60-100 млн.клеток в 1 мл, что соответ.15 ствует их 0,5" 17. -ной концентрации.
Сохраняемые в холодильнике взвеси можно длительно (не менее года) испольэовать для исследования, Для длительного хранения взвесь следует перенести в ампулы, добавить в них по одной капле разведенной краски. а перед провеДением исследования эритроциты однократно отмыть физраствором и развести до нужной концентра- yg ции, При диагностике бактериальных инфекций используют два вида эрнтроцитов, содержащих специфическую субстанцию микробов, Для определения специ- 30 фического изменения фагоцитоэа, связанного с образованием специфич ских антител, применяют эритроциты, содержащие антиген, а для определения специфической Реакции фагоцитов в на- 35 чальном периоде инфекции, до возникновения имунной реакции, — эритроциты, содержащие сложный комплекс антнгена ,и антитела. Для приготовления последних эритроциты, содержащие антиген, 40 инкубируют в течение 1 ч с соответствующей иммунной сывороткой активностью 8-16 гемагглютинирующих единиц по РПГЛ, отмывают их два раза от несвязаяшейся сыворотки и инкубируют в течение 1 ч с надосадочной жидкостью из взвеси соответствующих бактерий ипи с раствором специфического полисахарида или липополисахарида активностью не ниже 5 антигенньгх единиц по
РТПГА. Эритроциты трижды отмывают от
50 несвязавшейся части антнгена и разнодят до нужной концентрации, Аналогичньм образом подготавливают эритроциты, содержащие неспецифическин антиген, 55
Перед проведением диагностического исследования у-больного и постоянного контрольного лица, заведомо н имеюще го диагностируемой инфекции, берут из пальца кровь в объеме 0,050,10 мл, стабилизируют ее любым антикоагулянтом (0,01 мл гепарина,разведенного в соотношении 1:20; 37,-ный раствор цитрата натрия в соотношении
2:1 и т.д.). При невозможности использования одного постоянного донора берут кровь от двух любых здоровых людей. Каждую пробу крови вносят в отдельную пробирку в объеме 0,0250,050 мп, добавляют .равный объем смеси вэвесей специфического и неспецифического объектов фагоцитоза и помещают в термостат на 5-20 мин.
Пробирки регулярно встряхивают. Мазки из каждой пробы готовят на отдельном предметном стекле. глазки фиксируют и окрашивают пс Романовскому-Гимзе, микроскопируют под иммерсионным объективом, одновременно учитывая фагоцнтоз двух объектов, иэ которых одни имеют светло-синюю, а другие темно-красную или черную окраску. Определяют фагоцитарную активность
100 лейкоцитов. Площадь мазка условно делят на .-ри части и в каждой части учитывают по трети от общей суммы учигываемых лейкоцитов. Желательно, чтобы общая сумма фагоцитированных эритроцитоB бра не менее 100. Если при учете 100 лейкоцитов цифра фагоцитоза ниже этой величины, подсчет фагоцитоза продолжают до получения нужной суммы, По окончании подсчета вычисляют процент фагоцитнрующих клеток и среднее число фагоцитированных эритроцитов каждого вида на один из учтенных лейкоцитов (фагоцитарное число). Последний показатель более информативен, поэтому можно ограничиться только его определением. Фагоцитоз :боих видов эритроцитов у больного выражают в процентах к соответствующим показателям фагоцитоза у контрольного лица. Если в качестве контроля используют два лица, то для расчета процента берут средние вели" чины фагоцитоза у этих лиц. Делят относительные показатели фагоцитоза специфического и неспецифического объектов у больного и при величине отношения больше 1,5 и меньше 0,66 диагностируют инфекцию. Полученную относительную величину обозначают как индекс специфического изменения фагоцитоза (ИСФ). Величина индекса выше 1,5 указывает на специфическое
162799
30 усиление фагоцитоза, а ниже 0,66 " на его специфическое снижение, Способ можно применять также при использовании в качестве объектов фагоцитоэа бактерии, подобрав для
5 микроскопического различения бактерии, отличающиеся в мазклх крови по окраске или форме, Концентрация каждого нида бактерий во взнеси
10 должна быть около 1 млрд. микробных тел на 1 мп. Само исследование осуществляют аналогично описанному для эритроцитов.
Пример 1, Применение способа при диагностике кори, Для проведения дилгностическогo исследования использовали в качестве специфического объекта фагоцитоза эритроциты из сухого кnpeBnro лнти- 2(} генного диагностикумл для Р!П А производства Ленинградского И11ИЭИ им.Плсгера и в качестве неспецифического обьекта — эритроциты из сухого гриппозного антигенного дилгностикумл для 25
РПГА типа А Одесского предприятия по производству бактерийных преплратов.
Первый вид эритроцитон окрлшен синей краской, второй — черной, В процессе окрашивлиия обл вида эритроцитон сохранили cBQH лнтигенные свойства.
Предварительно н исследованиях у
197 лиц контрольных групп, cocTo 35 и контактных по ней, детей с аллергическими реакциями кожи,и у взрослых, не болевших и переболевших н прошлом корью, было установлено, что индекс соотношения фагоцитоза коревых и грип- 40 позных эритроцитов ие выходит зл пределы его контрольных значений 0,661,50. Двое детей в возрасте 8 мес и 6 лет поступили в инфекционную боль- 45 ницу на 1-й и 3-й дни забо.;евания с подозрением на корь. При исследовании определено, что у одного фагоцитоз коревых эритроцитов составил к их фагоцитозу у контрольного лица l09X, а фагоцитоз гриппозных эритроцитов 457, ИСФ равен 2,43. У второго ребенка те же показатели по отноше" иию к показателям контрольного лица составили 56 и 25Х, а ИСФ раван 2.24. На основании исследования было дано заключение о наличии у обоих больных специфического изменения фагоцитариой активности лейкоцитов, характерного 2 б дпя кори. Позднее дил ноз был подтвержден клиническим развитием болезни и положительным результатом определения против окоре вых антите JI в парныхн сыворотках, При обследовании 54 больных корью в катаральном периоде и на 1-8-й дни высыпания у 48 выявлено достоверно значимое изменение величины ИСФ (89K or числа обследованных). В том числе ИСФ выше 1,50 уст;новлен у 43 больных и ниже 0,66 — у пяти. В катаральном периоде и н первые дна дня высыпания положительная реакция была у всех обследованных (24 человека) и нл 3-4-й дни от нлчлла высыпания — у 20 из 22 (91 7 положительных результлтон). При оиределении титров противокоревых антител и антител к шигеллам Зонне в РИГА с расчетом индексов специфического поньш<ения титр< н антител по соотношению титров лнтител к зтнм двум лнтигенлм установлено, что у больных корью повьппен титр протинокореных антител н среднем н 20 рлз в сравнении с. ко троп ной групп<>й детей, Н< болевших кс ры< и IIe привитых пргтин нее. У всех больных индекс специфического повьш<ення титров выше 4,0, чт< свидетельствует о наличии н организме больных специфических прстинокоревых антител. Однако такие we показатели противокореных антител обнаружены у лиц из всех других контрольных групп, в тo» числе больных некоревыми инфекциями, У лиц этих групп инде к с спе цн<1 иче с к о го повышения fHTpoB противокореных антител был н тех же пределлх, что и у больных корью (8-128). Нл основании при однократном исследовании оказалось ненозможным дифференцировать больных корью и не болевыших этой инфекцией. Только при исследовании парных сывороток, полученных ll « с разницей но времени в 2-3 недели, четырехкратное нарастание титров противокоревых антител удалось определить у 507. больных корью, л при расчете индексов сг<ецифического повышения титров путем сравнения этих двух сывороток диагностическая величина индекса 4 и выше получена у 82Х больных, Таким образом, исследование по предлагаемому способу позволяет диагностировать корь на 2-3 недели раньше в сравнении с определе1627992 кием индексов специфического повышения титров антител ы повышает реэультатквность диагностики. П р н м е р 2 ° Применение способа при диагностике дизентерии. Дпя проведения диагностического исследования использовали сухие антигенные эритроцитарные диагностикуьи из шигелл Зонне и Флекснера Ленинградского НИИ вакцин и сывороток. Приготовлено два диагностических набора один " иэ контрастно окрашенных эритроцитов, содержащих антыгены Зонне и Фпекснер! другой — из этих же эрытро- 1 цитов с дополнительным присоединением я ним гомологнчных; антител и липополисахаридов. Дпя исследования фагоцитарной активности лейкоцитов испольэовали 1Х-ные взвеси всех видов эритроцитов. У больной, поступившей в отделение кишечных инфекций на 3-й день заболевания с подозрением на дизентерию, было проведено исследование по пред" 25 лагаемому способу в день поступления и через 8 дней. Одновременно проведено исследование с кровью двух доноров, В одну порцию каждой пробы кровы добавили смесь взвесей эритроцитов, 30 сенсибилнэнрованных антигенами Зонне к Фпекснер, в другую порцию — эритроциты, содержащие сложный комплекс этих антигенов и антител. Показатель флагоцитарного числа в отношении всех видов эрктроцитов у больной выражен в процентах к средней величине фаго цитоэа каждого вида эритроцитов у . контрольных лиц. У больной показатели составили в отношении разных эритро- 40 цитовi с антигеном Зонне 71Х, с актнгеном Фпекснер 167Х, содержащих комплекс из антигена и антитела Зонне 161Х и комплекс иэ антигеиа и антитела Флекснер 292Х. ИСФ по соотко- 45 шенкю фагоцктоза первых двух видов эритроцитов близок к единице, а по соотношению фагоцитоза эрытроцытов с комплексом Флекснер ы Зонке 1,81. На основании исследования было дано заключение о наличии у больной дизентерии Флекснер в фазе циркуляции в крови субстанций шыгелл Флекскера при отсутствии иммунной реакции. Че", рез неделю у этой больной было полу; чено бактериологическое подтверждение дизентерии с выделением шигелл Флекснера 2а. Исследование через 8 дней выявило повышение ИСФ до 1,79 по соотношению фагоцитоэа эритроцитов, содержащих актигены Флекснера и Зонне, и отсутствие реакции на эритроциты, содержащие сложный комплекс антигена и антитела. Результаты исследования указывают на прекращение цир- . куляции антигена в крови и наличие иммунной реакции. Исследование в РПГА титров антител к шигеллам Зонне и Флекснера при поступлении показало отсутствие значимого специфического сдвига титров антител (индекс ниже 4,0). При втором исследовании отношение титров к шигеллам Флекснера и Зонне указывало на наличие диагностически значимого сдчига (превышение титра антител к шигеллам Флексиера в 8 раз и величина индекса равна 8), что также подтвердило диагноз дизентерии Флекснера. Предлагаемым способом обследовано 24 больных острой дизентерией, в том числе 16 с дизентерией Флекснера и 8 с дизентерией Зонне. У 17 больных срок заболевания был 2-4 дня и у 7 6-17 дней. Диагностнчески значимое повышение индекса с величиной ИСФ выше 1,5 получено у 22 больных (91,7Х положительных результатов). Иэ них у 2) больного было полное совпадение эаклю ения о типе шигелл с данными бактериологического исследования . При исследовании титров антител в РПГА диагностически значимое повышение индекса соотношения титров антител к обоим видам шигелл установлено у 9 больных (38Х положительных результатов), в том числе в первые 2-4 дня заболевания у 5 из 17 (29K положительных результатов). При обследовакии 57 больных соматическими заболеваниями и сальмонеллеэом ифимуриум ни у одного больного не выявлено специфического изменения фагоцитоза эритроцитов, содержащих субстанции шигелл. Пример 3, Применение способа при диагностике туберкулеза. Дпя диагностического ксследовакия использованы сухие антигенные эрытроцитарные диагностикумы для РНГА JIeнкнградского НИИ вакцин и сывороток— туберкулезный (фосфаткдный) к нз аыгелл Зонне (неспецифическкй объект фагоцитоза). Оба вида эритроцытов окрашены в контрастные цвета. Иэ туберкулезных эритроиытов приготовлены клетки с .присоединением к нкм 9 162 антител из прила-немой к диагностикуму иммунной сыворотки с последующей фиксацией на них специфическсй субстанции надосадо Иной части центрифугата взвеси БЦЖ. Эритро.(иты cG сложным комплексом из шигелл Зоине получены описанным способом. Для исследования использовали 17,-ные взвеси эритроп11тов, беря смеси однотипных по структуре эритроцчтон. При обследовании 500 детей, Вакцинированных и ненакцинированных ЩЖ и не болеюцих туберкулс зом, установлено, что н первые дна года после вакиинаиии выявляется специфическое повышение фагоцитоза. После этого срока реакция исчезает и при отсутствии туберкулеза величина ИСФ не выходит за пределы к<)нтрольного гначения. У взрослых, не 6о1!ен!"их тубе:..-,у— леэом, исследонаг!и прс длагаемым. способом также выяв;«crвие специфического измене»ия фа;о>ц,тоз». Таким образом, у де!е!! старю(двух лет и взрослых ныянле»ие crl(r»r 172 ребенка, больных и инфицирсванных туберкулезом, и 18 взрослых. Положительный диагностический результат при однократном исследовании получен у 81,21. Определение антител у этих больных не проводили из-за 7992 i0 отсутствия нужного количества диагностикума. Преимущество предлагаемого способ=< иммуноднагностики и сравнении со способсм определения титров антител в РПГЛ и расчетом индекса соотноше»ия титров специфических и неспецифических антител в сопоставлении с их соотношением у контрольных лиц заклкч;ется н повышении точности. При исследовании предлагаемьгм спссобом специфический и неспецифический показ, тели о! ределяют в одной г,орции крс ни, а при исследонании известным с:r()c<-бом каждый показ>«тель определяют н раз»ых порциях, Поэтому по предлагз-мему способу диагностически значт<и поньпхение индекса выше 1,5, а по известному — вь!ше 4. Кроме того, по известному crr() =обу диаг>!остический критерий b.:rr«eg(тс лько для случая и вью< »ия r èãða специфических антител, и согп;-:с»с п!)eдлагпемому — также для cr«y« r специфической депрессии пока«ателя (И1!деке ниже О, 66) . . В сс ответствии с отим предлaraeмый < !< с об пс.!Воля. г раньше диагностир<>1 .>т1, и»4 .кцию, В ч>зс 1 ности, при 30 лизе!ггерии 1>рс д1!ель»ых ре . льтатон, а известный .иск.о<) — около 307a ° Так«к обра«ом »редда! ае!<ый сг особ н начал!— и )II (г !Ilи !або.!(!Вания н ТрН p >за i!>Е К З 1< 1< ! Е Е ° r)c .еь»!о з»ачитсль!!о и,)еиыyщсстно преилпгасм< г > с!!ос< 6а 1! сроках ди;!!»ос г«1<» и;;и кори, когда определе40 i!>1(,>1> 1 и! <«и ) с>е)п> ных )ффек тин но то. \ь « <> r<<> 1lpl> и(!е -с.;;;»I al!111« r . «р»1,<.;:;-I lrro >< >)< . ) к 11 и > 1! <), я (= г и >!rуч 1 1 >ил r!Inc тичес >(!!i! рс зул). г черс «2-3 пс дсли от»;!»=л;! aabîëåâarr>«H, Предлагаемый err<)c Об) Д(!ет в начале I>r 6n;re!«(«rrrr)r ! 00 — ый полс, !тельиыи ре «ульт lT y>.(пс>«воняет ди.!г»ос ги!ровать ьорь на 2-3 недели раньи!е, i,>p -.>лага(.: способ позволяет oni>;;1(-1rè гь ка! с»язанное с оГ>рас«ованием имму»ньгх антител, т;>к и не связанное с ни..! специфическое изменение
ПРИ ВСсЗНИКНОНЕНИИ ИММУННОЙ РЕаКЦИИ. В связи с этим предлагаемья! способ позволяет дифференцировать корь от других инфекгц!Й, а при применении 1627992 Формула изобретения Составитель А, Бонарцег Техред Л.Олийнык Корректор Н. Король Редактор А.Огар Заказ 338 Тирам 408 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям н открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д. 0/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г,ужгород, ул. Гагарина, 101 известного способа пан однократном исследовании крови это невозмошио. Предлагаемый способ значительно эффективнее известного способа иммунодиагностики за счет определения фагоцитарной активности лейкоцитов в отношении микробов. Известный способ не стандартизован и не дает унифицированного количественного критерия диагностики. Предлагаемый способ вводит такой критерий. Кроме того, применение известного способа ограни ено кругом бактериальных инфекций, а предлагаемый способ универсально применим для диагностики любой инфекции» Изобретение монет быть применено в практическом здравоохранении с нспользованием известных и широко доступных средств иммунодиагностнкм, инфекций. Способ иммунодиагностикм инфекций путем добавления исследуемой крови к специфическому и неспецифкческому эритроцитарному диагностнкуму с последующей оценкой результатов реакции по соотношению показателей мекду специфическим и неспецифическим- диагностикумами у больных н здоровых лиц, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью повышения точности способа, к исследуемой крови добавляют смесь предварительно окрашенных эритроцн" тарных диагностикумов, а оценку результатов ведут по определению фагоцитарной активности лейкоцитов и при соотношении показателей больше 20 1,5 и меньше 0,66 диагностируют ин" фекцню»
