Способ определения активности гормонов тимуса

 

Изобретение относится к биологии, медицине, химико-фармацевтической промышленности и касается способов определения биологическом активности iормонов. Цель;о изобретения является повышение точности способа за счет ныявления индукторной биологической активности гормонов тимуса. Цель достигается том, что определяют индукторную активность гормонов тимуса, для чего используют клетки монослойной культуры гепатоцнтов, предварительно стимулированные тимичегким гормоном. Стимуляцию проводят гормональным фактором тимуса (в дозе 0,1 мг/мп), а инд -кторную активность определяют как способность супернатанта гепатоцитов, стимулированных гормоном, увеличивать количество розеткообраэующих клеток среди Т и В пимфоцитов периферической крови человека по сравнению с контролем , в качестве которого используют уровень розеткообрачованпя лимфоцитов н присутствии супернатанта гепатоцитов , не стимулированных гормоном. S СЛ

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1622820 А 1 (51)5 G О1 И 33 53

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

llO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4342121/14 (22) 10.12.87 (46) 23,01.91, Вюл. N 3 (71) Читинский г осударс тле цып медицинский институт (72) С. Г, 1Сзлашг(икон, Л.11. ".1алс.,(((( и Б. И. Куэ пик (53) 615.375(088.8) (56) Авторское сви;(етельстно ССLГ

824051, кл. (, 01 iV 33/53, 1981, (54) С11(1С08 011РЕ(1ЕЛЕНИЯ АКТ11811()С 1 И

ГО(MOHОВ ТИ1" СА (57) Изобретение относится к «полонин, медицине, химикс -фармацевтичее кои промышленности и ка с аетс я способов опр едел .ния био гогической актив(ос:т ((оpмонов. Целью изобретения являе.. ся повышение точности сг(особа за счет выИзобретение относится к биоло. ии, медицине, химико-ф,грл(ацевтической промы(шгенности и касается способов определ ения биоло гич ес кои активности гормонов, Целью изобретения является повышение точности с пособа за счет выявления индукторнои активности гормонов тимуса.

Цель достигается тем, что определяют инлукгорную активность гормонов тимуса, для чего используют клетки монослоиной культуры гепатоцитов, предварительно стимулированные тимическим гормоном. Стимуляцию проводят гормональным фактором тимуса (в дозе

0,1 мг/мл), а индукторную активность

2 явления индукторной биологической актив((ости гормонов тимуса. Цель достиг lется тс.л(, что определяют индукторную активность гормонов тимуса, для чего используют клетки л(онослойной культуры гепатоцитов, предварительно стимулированные тимическим гормоном.

Стимуляцию проводят гормональным фактором тимуса (в дозе 0,1 мг/мгг), а индукторную зктивн<1сть определяют как способ((ость супернатанта геггатоцитов, стимулированных гормоном, увеличивать количгство розеткообраэующих клеток среди г и H лимфоцитон периферической крони человека по сравнению с контролем„ в качестве которого используют уровень роэеткообра.гона(игя лимсроцитов н присутствии супернатанта гепатоцитов, ((е стимулированных гормоном, С: определяют как способность супернатанта гепатоцитов, стимулированных гормоном> увеличивать количество роэеткообраэующих клеток среди Т и В лимфоцитов периферической крови человека по сравнению с контролем, в ка честве которого используют уровень роэеткообразования лимфоцитов в присутствии супернатанта гепатоцитов, не стимулирован.(ых гормоном. Метод основан на способности гормонов тимуса оказывать не только прямое коррегируищее влияние на дифференцировку иммунгкомпетентных клеток, но и индуцировать продукцию вторичных иммунсрегуляторных медиаторов клетками различных органов и тканеи.

1622820

Способ осуществляется следующим образом.

Стерильно извлеченную печень животного через нижнюю полую вену перо 5 фуз ируют при 3 7 С 250 мл О, 02%-ного раствора Версена с содержанием 0,05% коллагеназы и 50 ед/мл пенициллина и стрептомицина, после чегс осуществляют дополнительную перфузию 80 мл раст-10 вора Хенкса с 0,005 M содержанием

Са и 0,05% содержанием коллагеназы.

Далее печень тщательно измельчают, трехкратно отмывают от осяатков крови 30"40 мл 0,02%-ного раствора Вер- 15 сена. Отмытую ткань заливают 200 мп среды Игла с 0,05% коллагеназы и ино кубируют 15 мин при 37 С с постоянным встряхиванием, После этого клетки трехкратно отмывают при О С 80 мл среды Игла от остатков коллагеназы, Полученную суспензию пропускают при о, О С через стерильную колонку 20х2 см, заполненную стекловатой для очистки суспенэии от клеток макрофагально-мо- 25 ноцитарного ряда, после чего клетки оставляют оседать, Затем надосадочную яядкость отсасывают, клетки помещаюч в инкубационную среду: среда Игла,О ., эмбриональная телячья сыворотка 20,. пенициллин стрептомицин по 10о мкг/мл., Э

Содержание клеfOK о о 3 1О гепатоцитов/мл, Жизнеспособность клеток проверяют окрашиванием изотоническиг.

О 6 %-ным раствором трепанового синеО

35 го. Клеточную суспензию переносят в чашки Петри с находящимися в них предварительно сенсибилизированньми коллагеном предметными стеклами из расчета 4 стекла на чашку. Инкубация в среде 95% 0< и 57. СО в те .ение

5-6 ч, За это время клетки адаптируются и образуют монослой на предметных стеклах. Не прикрепившиеся клетки удаляются вместе с культурально 1 средой.

Оцновременно со сменой среды в каждую культуру добавляется гормональный фактор тимуса в разведении

О 1 мг/мл. После часовой совместной э 50 инкубации оценивается способность супернатанта от гепатоцитов, стимулированных гормоном тимуса, влиять на экспрессию рецепторного аппарата лимфоцитов полученных из периферической

Ф

55 крови человека. Для этого содержание лимфоцитов, выделенных на градиенте плотности фиколл-уротраст, доводят до 3 10 кл в 0,9 мл среды 199 с

10%-ным содержанием эмбриональной телячьей сыворотки, после чего к 0,9 мп суспензии лимфоцитов добавляют по

О, 1 мл супернатанта гепатоцитов, стимулированных гормоном. Каждую пробу супернатанта добавляют в две пробирки с суспензией лимфоцитов: в одну для определения влияния на экспрессию рецепторов 1 .-клеток, в другую — В-клеток, Одновременно с этим в отдельную пробирку с 0,9 мл суспензии лимфоцитов для определения прямой биологической активности соединения вносят

0,1 мл гормона тимуса в концентрации

0.1 мг/мл, Далее лимфоциты инкубируются в течение 1 ч, после чего отмываются, помещаются в 0,2 мл среды 199 с 10%-ным содержанием эмбриональной телячьей сыворотки В пробирку для определения Т-лимфоцитов добавляется

0,2 мл отмытых эритроцитов барабана, в пробирку для определения В-лимфоцитов помещается 0,2 кл суспензии зритроцитов барана, сенсибилизираванных гемолитичсской сывороткой и обработанных комплементом мыши. Клетки инкубируются при 37 С в течение 15 мин, после чего в пробирках для определения на Т-лимфоциты подсчитывается содержание "а явных" розеток. Далее суспензия лимфоцитов помещается на 1 ч в ледяную баню, Пробы для определения влияния на В-лимфоциты сразу помещаются на 1 ч в ледяную баню, затем подсчитывается количество общих" розеткообразующих клеток в популяции Т-лимфоцитов и количество розеткообразующих клеток в популяции В-лимфоцитов, 3а единицу прямой биологической активности гормона принимается способность препарата в разведении

0,1 мг/мп усиливать розеткообразование среди Т-лимфоцитов периферической крови человека на 1%, тогда как единицей инлукторнои активности считается способность гормона в дозе 0 1 мг/мп обеспечивать выброс в супернатант гепатоцитов такой дозы соединений, которая вызывает стимуляцию розеткообразования в совокупности лимфоцитов периферической крови человека под влиянием супернатанта на 1%. В качестве контроля используются показатели розеткообразователя в присутствии супернатанта гепатоцитов, не стимулированных гормоном тимуса, и в присутствии культуральной среды, 1б 22820

Пример, Стерильно извлеченную крысиную печень перфузируют через нижнюю полую вену при 37 0 250 мл

0,02%-ного раствора Версена с содержанием О, 05% коллагеназы и SO ед/мл пенициллина и стрептомицина, после чего осуществляют дополнительную перфузию 80 мл раствора Хенкса с 0,05 M содержанием Са и 0,05% содержанием коллагеназы. Далее печень тщательно измельчают, трехкратно отмывают от остатков крови 30-40 мп

0,02%-ного раствора Версена. Отмытую ткань заливают 200 мп среды Игла с

0,05% колпагеназы и инкубируют 15 мин при 37 С при постоянном встряхивании.

После этого клетки трехкрат)lo QTMb)Bnt))T при 00(; 80 мл среды Игла от остатков коллагеназы. Полученную суспензию про- 20 пускают при 0 С через стерильную колонку 20 см х 2 см, заполнен ую стекловатой дпя очистки eye)ie)ti)t)» от клеток макрофагапьно-моноцитарного ряда, после чего клетки остав))яют оседать, 25 затем надосадочную жи,)когть отсасывают, клетки ломе)цают в инкубац))опную среду: среда Игла 80%, змбрионапь))n)I теляч) я сыворотка 20., пени))иппин, стрептомицин по ОО мкг/чп. (. ))д(ржа- 30 ние клеток доводят 3 ° 10) гепатоцитов/мп 1(и.)неспосо(>ность клеток проверяют окрашиванием изотоническим

О,б%-ным раствором трепаново) о синего, Клеточную суспензию переносят I) чашки

1(етри с находящимися в них предварительно сенсибил)»зирован)изми коппагеном предметными стеклами из расч та

4 стекла на )а)ику, Инкубация в среде

95% Ог и S% С()а в течение 5 6 ч 3а 40 это время клетки адаптируи)тся и образуют монослои на предметнь)х стеклах. Не прикрепившиеся клетки удаляются вместе с культурапьной с рсдой, Одновременно со сменои среды в каждую 45 культуру добавляется полипептидныи фактор тимуса — тималин в разведе;)ии

0,1 мг/мл. После часовои совместной инкубации оценивается способность супернатанта от гепатоцитов, стимупи- 5Q рованных тималином, влиять на экспрессию рецепторного аппарата пимфоцитов, полученных из перифеоическои крзви больных с ожоговои травмой II, III степени. Для этого содержание лимфоцитов, выделенных на градиенте плотност)» фиколп-уротраст, доводят до

3 10 кл в 0,9 мл среды 199 с 10 ньв» содержанием эмбриональной телячьй сыворотки, после чего к 0,9 мп суспензии лимфоцитов добавляют по 0,1 мл супернатанта гепатоцитов, стимулированньи» одним из разведений тималина, Каждую пробу супернатанта добавляют в

2 пробирки с суспензией лимфоцитов: в одну для определения влияния на экспрессию рецепторов Т-клеток, в другую — В-клеток. Одновременно с этим в отдельную пробирку, содержащую 0,9 мл суспензии лимфоцитов, вносят 0,1 кп тималина в концентрации 0,1 мг/мл для определения прямой биологи еской активности соединения, Лимфоциты инкубируются в течение 1 ч, после чего отмываются, помещаются в 0,2 мп среды

199 с 10%-ным содержанием эмбриональной телячьей сыворотки. В пробирку дпя определения Т-лимфоцитов добавляется 0,2 мл отмытых эритроцитов барана, в пробирку для определения В-п)»мфоц))тов помещается 0,2 мп суспензии ..)ритроцитов барана, сенсибилизированных ) смопитической сывороткой ц обработанных комплементом мьпии, Клетки о. и кубируются при 37 (, в течение

15 мин, после чего в пробах для определения влия пия )tn Т-пимфоциты подсчитываетгя сoJ(сржа))ие "активных" розеток. Д))лс е суспензия пимфоцитов пом» ии)< тся )ln 1 ч п пе))якую б)аню, пробы дпя опредепегн)я впия) ))я на В-лим)))он)»т)) сразу помеи(аются t) ледяную баню па 1 ч, затем подсчитывается колич ес TE)() "об)ч)»х" ро зеткообра з уюцих клеток в популяции Т-пим)роцитов и количество розеткообраэующих клеток в популяции В-пимфоцитов. 8 качестве контроля используют показатели розеткообразования в присутствии супернатанта гепатоцитов, не стиму"ированных тимапипом, и в присутствии культурапьнои среды.

Предлагаемый способ, в отличие от известного позволяет не только более глубоко анализировать иммунорегулятор,;ую активность тимических гормонов путе)) одновременной количественной оценки их прямои и индукторной активности, но и дает возможность выявить даже минимальные колебания их урания среди тималина различных партий. Все это делает предлагаемый способ более качественным и точным, особенно при определении биологической активности тимических гормонов, использующихся в виде лекарственных препаратов.

16 22820

Формула изобретения

Составитель В, Бонарцев

Техред М.дидык Корректор О, Кравцова

Редактор И, Шмакова

Заказ 108 Тирах Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., л. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.ужгород, ул. Гагарина, 101

1. Способ. определения; активности гормонов тимуса путем оценки их действия на процесс реакции розеткообразования лимфоцитов, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повыщения точности способа за счет выявления индукторной активности гормонов тимуса, перед оценкой реакции проводят иикубацию монослойной культуры гепатоцитов в присутствии гормона с

5 последующим отделением супернатанта, его очисткой от остаточного количества гормона, внесением в суспензию лимфоцитов периферической крови, инкубированием, а оценку осуществляют по возрастанию числа Е-POK и ЕАС-РОК,