Способ отбора препаратов микробных аллергенов для иммунодиагностики

 

Изобретение относится к медицине , а именно к стандартизации коммерческих препаратов, Цель изобретения - повышение точности способа. У взрослых доноров и из пуповинной крови выделяют лимфоциты, которые инкубируют с аллергенами , центрифугируют и супернатянтами обрабатывают нёйтрофилы, выявляют их активность в реакции восстановления нитросинего тетразолия, вычисляют разницу в активности опытных проб и контроля Рез аллергена и при показателях разницы у взрослых выше 20 и отсутствии ее у новорожденных препарат отбирают для иммунодиагностики. В сравнении с известным способом точность отбора увеличивается на 35%.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„, 16229

А1 (51)5 G 01 Б 33 53

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

М А ВТОРСИОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21) 4173416/14 (22) 04.01.87 (46) 15.02.91, Бюл, У 6 (71) Горьковский медицинский институт им.С.М.Кирова (72) А,Н.Маянский, С.П.Рассанон, Е,Г, Зеленова и В.М.Лукашков (53) 615.375(088.8) (56) Фрадкин В.А. Аплергодиагностика.

M,: Медицина, 1975, с.144, 1 (54 ) СПОСОБ ОТБОРА !РЕПАРАТОВ МИКРОБHblX АЛЛЕРГЕНОВ ДЛЯ ИММУНОДИАГНОСТИКИ (57) Иаобретение относится к медицине, а именно к стандартизации коммерИзобретение относится к медицине, в частности к стандартизации коммерческих аллергенов.

Цель изобретения — повышение точности способа.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом, Для исследования берут коммерческий аллерген или экспериментальные производственные серии аллергенов.

Лимфоци ы выделяют из пер сферической крови взрослых здоровых доноров и новорожденных (пуповинная кровь) на гр диенте плотности фиколл-верографина (1,077 кг/м ) центрифугиронанием при 300»g в течение 30 мин, дважды отмывают и ресуспендируют в среде 199 в количестве 3 млн.клеток на 1 мл.".!оноциты удаляют инкуба шей лимфоцитов в пластиковой посуде н теческих препаратов, Цель изобретения повышение точности способа. У взрослых доноров и из пуповичной крови. выделяют лимфоциты, которые инкубируют с аллергенами, центрифугируют и супернатянтами обрабатывают нейтрофилы, выявляют их активность в реакции восстановления нитросинего тетраэолия, вычисляют разницу в активности опытных проб и контроля без аллергена и при показателях разницы у взрослых выше 20 и отсутствии ее у новорожденных препарат отбирают для иммунодиагностики, В сравнении с известным способом точность отбора увеличивается на 351. чение 60 мин при 37 С. Жизнеспособность клеток определяют по трипановому тесту (должно быть не менее 94Х жизнеспособных клеток).

Лимфоциты взрослых доноров и лимфоцнты нов рожденных обрабатывают аллергеном н дозе 10 мкг/мл, инкубируя в термостате при 370С 40 мин, затем их отмывают от несвязавшегося аллергена, Далее лимфоциты взвешивают в среде 199 и культивируют в течение

72 ч при 37 С (опытные пробы). .В контрольных пробах лимфоциты культивируют беэ обработки аллергеном в аналогичных условиях. Выделяют супернатант центрифугированием при

600xg в течение 20 мин. В опьтных пробах смешивают О,1 мп цельной крови от взрослых доноров и по

0,025 мл 0,27,-нс го раствора нитроси1627993 н его тетразолия и супернатанта, полученного после культивирования клеток с аллергеиом, В контрольных пробах используют супернатант, полученный после культивирования без аллергенов.

Указанные компоненты осторожно перемешивают, затем инкубируют про бы в течение 30 мин при 37 С. В даль- 10 нейшем иэ содержимого пробирок или лунок готовят мазки, высушивают, фиксируют в течение 5 мин в метаноле, ядра докрашивают 7-10 мин 27.-ным водным раствором метилового зеленого, промывают и после высушивания микро— скопируют под иммерсией, Просматривают 100 клеток, результат выражают в виде процента нейтрофилов, содержащих при стимуляции грубодисперсные отложения диформазяна (восстановленная варма нитросинего тетразолия).Крите рием стандартности исследуемых препаратов, а следовательно, нх пригодности служат следующие показатели: при 25 разнице в активности с супернатантами (опыт-контроль) лимфоцитов взрослых выше 20 и отсутствии ее с супернатантами лимфоцитов новорожденных препарат считают стандартным. ЗО

П р и и е р 1. Коммерческий аллерген золотистого стафилококка (серия

12, Р ОКВ 471).

Димфоциты выделяют ча градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 кг/м ). Концентрация лимфоцнтон 3 млн.клеток на 1 мл. Затем смешивают равные объемы (по 1 мп) взвеси лимфоцитов и препарата аллергена (10 мкг/мл) и выдерживают 40 мин прн

37 С (опыт). Отмывают от несвяэавшегося аллергена, лимфоциты взвешивают в среде 199 и культинируют 72 ч при

37оС, В контроле лимфоциты культивируют без добавления аллергена в ана- 45 логичных условиях. Затем смешивают

0,1 мл цельной крови и по 0,025 мл тестируемого препарата (супернатант культур) и 0,2Ж-ного раствора ннтросинего тетраэолия, Паряллельно ставят опыт с супернатантами лимфоцитов взрослых и новорожденных. В контроле— супернатан ы лимфоцитов вэрогльы и новорожденных, полученные из культур, не обработанных аллергеном. Ингредиенты реакции осторожно перемешивают и

55 термостатируит в, .течение 30 мин при 37пС, Готовят мазки, высушивают, 1 фиксируют докрашивают их раствором метилоного зеленого, микроскопируют.

Подсчитывают 100 нейтрофилов, определяя процент стимулированных клеток, В опыте с супернатантом лимфоцитов взрослых доноров количество стимулированных клеток составляет 50, в контроле с супернатантом лимфоцитов взрослых доноров — !5. Разница между опытом н контролем — 35. В опыте с супернатантом лимфоцитов новорожденных количество этих клеток составляет 18, в контроле с.супернятантом лнмфоцитон.новорожденных — 18. Разница между опытом и контролем — О. Препарат в соответствии с предлагяемым способом считают стандартным.

Пример 2. Маточный аллерген мукор пуэилус на одной из стадий технологического получения (серия I, белок по Лоурн 0,750 мкг/мл).

Порядок проведения исследования аналогичен описанному в примере 1, Разница между опытом н контролем с супернатантами лимфоцитов взрослых доноров составляет 1 7, а разница между опытом н контролем с супернатантами лнмфоцитон новорожденных ранняется 2, Препарат не являлся стандартным.

С помощью предлагаемого способа обеспечивается поньппение точности на 35/ (по известному способу выбраковывают 547 препаратов аллергена, а с помощью предлагаемого — только

57.) .

Кроме этого, исключается необходимость введения препарата человеку при сценке его специфической активности, Это особенно важно для оценки качества препаратов на разных стадиях технологического процесса, так как . введение таких препаратов нежелательно. Пр : тгрнменении предлагаемого способа можно ограничиться взятием донорской крони.

Формула и э о б р е т е н и я

Способ отбора препаратов микробных аллергенов для иммунодиагностики, включающий забор крови от взрослых доноров, выделение лимфоцитов, инкубацню нх с аллергеном, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью поньппения точности способа, дополнительно производят забор крови из пуповинной кроьн новорожденных, выделяют лимфоцнты, инкубнруют их с аллергеном в

S 162799 дозе 8-IO икг/мп, далее обе пробы центрифугируют н супернатантамн обрабатывают нейтрофилы крови взрослого донора, выявляют их активность н реакции восстановления нитросинего тетраS золи" е вычисляют разницу между

3 Ф активностью нейтрофилов в пробах и контроле без аллергена и пди пока зателях разницы показателя у взрослых выше 20 и отсутствии ее у новорожденных препарат отбирают для им" муноднагностикн.

Составитель В,Литовченко

Техред Л.Олийнык

Корректор А.Осауленко

°:..

Редактор A.Orap 1

Заказ 338 Тираж 407 Подписное 3

SHHHIIH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101