Способ определения амилазной активности рубца жвачных животных

 

Изобретение относится к микробиологии , в частности к способам определения амилазной активности в рубце жвачных животных . Цель изобретения - ускорение, упрощение и удешевление способа. Для определения амилазной активности в рубцовую жидкость вносят подкрахмальную индикаторно-субстратную микропленку, содержащую крахмал, желатин, йод кристаллический и йодистый калий при массовом соотношении компонентов: 0,0004:0,0004:0,0033:0,0066 на 0,04 мл дистиллированной воды. Инкубацию осуществляют до полного обесцвечивания микропленки и оценивают количество крахмала, расщепленного в единицу времени. 3 табл. Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 С 12 0 1/00

ГОСУДАРСТВЕHHblA КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4612729/13 (22) 30,11.88 (46) 15,03.91. Бюл. М 10 (71) Кишиневский государственный медицинский институт и Институт зоологии и физиологии АН МССР (72) Ф.И.Георгица, В.M.Íèêèòèí, Н,Н.Карлина и Ф.А.Струтинский (53) 577. 15(088.8) (56) Никитин В.М. Справочник биохимической экспресс-индикации микробов. Кишинев. Картя молдовеняскэ, 1986, с. 91 — 94.

Долгов И.А. Выделение и индентификация амилолитических бактерий рубца жвачных. В кн.: Новые методы и модификации биохимических и физиологических исследований в животноводстве. Боровск, 1972, с.

85-88.

Изобретение относится к микробиологии и предназначено для ускорения определения амилазной активности микроорганизмов в рубце жвачных животных.

Цель изобретения — упрощение, ускорение и удешевление способа.

Изобретение осуществляется следующим образом.

В отфильтрованную рубцовую жидкость вносят йодкрахмальную индикаторно-субстратную микропленку. которая содержит крахмал, желатин, йод кристаллический и йодистый калий в соотношении, мас. ь:

0,0004:0,0004:0,0033:0,0066 на 0,04 мл дистиллированной воды, Микропленку инкубируют в рубцовой жидкости до полного обесцвечивания и расщепления йодкрахмального комплекса черного цвета и рассчи„„ 4 „„1634717 А1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИЛА3НОЙ АКТИВНОСТИ РУБЦА ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ (57) Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам определения амилазной активности в рубце жвачных животных. Цель изобретения — ускорение, упрощение и удешевление способа. Для определения амилазной активности в рубцовую жидкость вносят подкрахмальную индикаторно-субстратную микропленку, содержащую крахмал, желатин, йод кристаллический и йодистый калий при массовом соотношении компонентов:

0,0004:0,0004:0,0033:0,0066 на 0,04 мл дистиллированной воды. Инкубацию осуществляют до полного обесцвечивания микропленки и оценивают количество крахмала, расщепленного в единицу времени. 3 табл. тывают количество крахмала, расщепленного в единицу времени. Желатин выполняет функцию твердофазного носителя крахмала и раствора Люголя (йода кристаллического и йодистого калия), Внесение в рубцовую жидкость йодкрахмальной индикаторносубстратной микропленки исключает многоэтапность исполнения анализа, полное расщепление крахмала (обесцвечивание микропленки) происходит в течение 5 — 30 мин инкубации, что в 5 — 10 раз ускоряет исследования (табл, 1).

Применение йодкрахмальной индикаторносубстратной микропленки позволяет повысить экономичность проводимых анализов, так как расходуется меньше реактивов (табл. 2), Способ иллюстрируется примерами.

1634717

Пример 1. Для приготовления микропленки в пробирку 1 вносят растворимого крахмала 0,1 г, приливают 7,9 мл дистиллированной воды, взбалтывают и нагревают над горелкой, доводя до кипения, и получают прозрачный раствор крахмала (субстрата). В пробирку 2 берут 1,0 г пищевого желатина и заливают 9,0 мл холодной дистиллированной воды, выдерживают 40—

60 мин, нагревают, не доводя до кипения, при непрерывном помешивании до получения прозрачного раствора желатина. Далее в пробирку 1, содержащую субстрат, вносят раствор жетатина 1,0 мл и раствор Люголя

1,0 мл.

Раствор Люголя готовят предварительно по прописи: кристаллического йода 1 г, йодистого калия 2 г, воды дистиллированной 300 мл. Сначала растворяют в небольшом количестве воды йодистый калий, после чего добавляют кристаллический код.

По растворении смеси прибавляют дистиллированной воды до 300 мл.

Раствор в пробирке 1 тщательно перемешивают и получают йодкрахмальную индикаторно-субстратную пленочную смесь черного цвета, которую наносят с помощью пипетки-дозатора каплями объемом 0,04 мл на гидрофобную поверхность бумаги, покрытой полимерной пленкой.

Таким образом, при расчете в массовых единицах йодкрахмальная индикаторно-субстратная микропленка содержит крахмала 0,0004 г, желатина 0,0004 r, кристаллического йода 0,0033 г, йодистого калия 0,0066 г на 0,04 мл дистиллированной воды.

Бумагу с нанесенными к;;п> ями оставляют при комнатной температуре на 18—

24 ч, затем выдерживают в термостате при

35 — 45 С до полного высыхания и образования автономных йодкрахмальных индикаторно-субстратных микропленок черного цвета, которые отделяют от поверхности бумаги. Микропленки собираясь и хранят во флаконах при комнатной температуре в течение 2 лет (срок наблюдения).

Для определения амилазной активности рубца жвачных животных в пробирку приливают 0,5 мл надосадочной или отфил ьтрованной части рубцового содержимого.

Затем вносят йодкрахмальную индикаторно-субстратную микропленку черного цвета с помощью бактериалогической петли, смачивают и прикрепляют ее к стенке пробирки, инкубируют при 37-39 С до полного обесцвечивания микропленки (до 30 мин).

Наблюдения за сменой окраски микропленки осуществляют визуально через стеклянную дверь термостата с целью поддержания постоянной температуры. Расчет результатов амилазной активности рубцового содержимого производят по формуле

А мг — - амилазная активность ()

Б мин где А — количество крахмала, содержащегося в микропленке, мг;

Б — время полного расщепления крахмала микропленки, мин.

Результаты представлены в табл. 1.

Пример 2. Способ осуществляют в соответствии с примером 1, варьируя содержание компонентов в составе микропленки, Результаты представлены в табл. 3.

Из табл. 3 следует, что оптимальным соотношением крахмала, желатина, кристаллического йода и йодистого калия в составе микропленки является соответственно, мас. 0,0004:0,0004:0,0033:0,0066 на 0,04 мл дистиллированной воды.

Формула изобретения

Способ определения амилазной активности рубца жвачных животных, предусматривающий инкубацию рубцовой жидкости с крахмалом в качестве субстрата, оценку расщепления крахмала по реакции с йодсодержащим реактивом и последующий расчет количества крахмала, расщепленного в единицувремени, отл ича ющийся тем, что, с целью ускорения, упрощения и удешевления способа, инкубацию с крахмалом и оценку его расщепления осуществляют одновременно путем внесения в рубцовую жидкость крахмала и йодсодержащего реактива в виде йодкрахмальной индикаторносубстратной микропленки, содержащей крахмал, желатин, кристаллический йод и йодистый калий при массовом соотношении компонентов соответственно

0,0004:0,0004;0,0033:0,0066 на 0,4 мл дистиллированной воды, и последующей инкубации до полного обесцвечивания микропленки.

1634717

Таблица1

П р и м е ч а н и е, B 1 микропленке содержится 0.4 мг крахмала, Таблица2

Способ

Известный

Предлагаемый

249,396 мг

Реактивы и аппаратура, необходимые для осуществления способов

Калий фосфорнокислый двухщамещенный, мг

Калий фосфорнокислый одноэамещенный, мг

Крахмал растворимый

Раствор Люголя, мл

1 н. раствор соляной кислоты, мл

Желатин, мг

Фотоэлект около имет

04 мг

0,004

0,4

Не т еб ется

81,696 мг

120,0

0,5

0,5

Т еб ется

1634717

О

Ф о

Ф

C

О и со сс! о

»О

С5

Е

Ь

»о

О

LA

О

М

2 х (0

О с( с

О

S

О

Ф с.»

СО

» 1

Q Ф

ЕХЕ с(,Е S

О2с

Я ).

1 с»»«Е са И О

Ф &

Е эЕ

О у ас Е / Y

Ф

Z

Х

Ф

Е

Е

С1

C йЮ

Ф S

)(I» с

Щ

E х

О.

Y

2

Ф

Щ с

X х

Ф «О

С4

Е с

О

z а

О х с Е

Е Ф ,е с

i C

Ф Й и х сО Е ао

М Z с »О Ф е а

»2 о

I- ID

Х:>

Ф и

О

X

О

ЪС с

»- 1Е д

« с ЯО с"> n o с с"> с «" o с? " с > с» о с с">

I CVCVIAcVeV !

nnОnn

„о„ с с- О«: n

-ОС Ъ «О со

-сосО

С Ъ «О сО! I 1--!

I I I - I !

° !

I I t I I I

С9

I ! - I !

« 3

С »! LA I I I

ООООООО Ф Ф 3 Ф с-» сГ

ООООООО

LA lA CD CD С«» «Р

OOOOOO

LA CD В»

ООООООО

OOOOOOO

«, LA n С"Ъ . LA

О О« О О

О с-) О о О о О

О Î О

ООООООО,Д LA . lA A lA

СЧ О О»

OÎÎOÎOÎ

О О О О

О ООООО

О ООООО

CV С Ъ W LA

LA «,> IA 1. LA с!-» LA

ООООООО

О О О

О -О .О -О

Оо ООО«-) О

OOOOOOO х

X

IО

K х

Z

М

CII

=т

CD л

О.

CD

О а

01