Способ определения перекиси водорода в биологических объектах

 

Изобретение относится к способам биохимического анализа и может быть использовано для определения перекиси водорода в биологических образцах и системах, генерирующих . Цель изобретения - повышение чувствительности способа при одновременной возможности осуществления способа в присутствии гемсодержащих пигментов. К исследуемой пробе добавляют буферный раствор, пероксидазу , а также смесь гваякола и паминодиэтиланилина при концентрации каждого компонента 0,05-0,5 мМ. Пробу инкубируют до прекращения увеличения оптической плотности и спектрофотометрируют против контрольной пробы, не содержащей перекиси водорода . По величине оптической плотности определяют содержание перекиси водорода. Способ позволяет повысить чувствительность в 2,5 раза. 2 табл. с 5S (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„.90„„1636772 (g1)$ С 01 1 33/52

<" : < 61@я н;е *ИВ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOIVIV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4363857/14 (22) 13. 01. 88 (46) 23.03.91. Бюл. Р 11 (71) Львовское отделение института биохимии им. А.В.Палладина (72) M.Â.Ãoí÷àð и A.À.Ñèáèðíûé (53) 612.016(088 ° 8) (56) Portsmann В,, Portsmann Т., Nagel Е. — Clin.Chem. Clin. Biochem, 1981, v 19, р.435-439. ,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА В БИОЛОГИЧГСКИХ ОБЪЕКТАХ (57) Изобретение относится к способам биохимического анализа и может быть использовано для определения перекиси водорода в биологических образцах и системах, генерирующих

Изобретение относится к способам биохимического анализа и может быть использовано для определения перекиси водорода в биологических образцах.

Цель изобретения — повьппение чувствительности способа при одновременной возможности осуществления способа в присутствии гемсодержащих пигментов.

Способ осуществляется следующим образом.

К исследуемой пробе добавляют буферный раствор, пероксидазу и в качестве хромогена смесь гваякола и и-аминодиэтиланилина При концентрации каждого компонента 0,05-0,5 M. Пробу инкубируют до прекращения увеличения

Н О . Цель изобретения — повьппение чувствительности способа при одновременной возможности осуществления способа в присутствии гемсодержащих пигментов. К исследуемой пробе добавляют буферный раствор, пероксидазу, а также смесь гваякола и иаминодиэтиланилина при концентрации каждого компонента 0,05-0,5 мМ. Пробу инкубируют до прекращения увеличения оптической плотности и спектрофотометрируют против контрольной пробы, не содержащей перекиси водорода. По величине оптической плотности определяют содержание перекиси водорода. Способ позволя"т повысить чувствительность в 2,5 раза.

2 табл. с оптической плотности и спектрофотометрируют против контрольной пробы, не содержащей перекиси водорода. По величине оптической плотности определяют содержание перекиси водорода.

Пример 1. Анализ перекиси во- дорода в растворах.

ЬР

К 10-2000 мкл анализируемой пробы, содержащей 10-500 нмоль Н О прибавляют 400 мкл 0,5 M фосфатного буфера, рН 7,0-7,5, 400 мкл 2 мМ гваякола и 400 мкл 2 мИ сульфата 3 и-аминодиэтиланилина (или дигидрохлорида и-аминодиметиланилина). Объем проб доводят до 3,8 мл водой. Реакцию начинают прибавлением 200 мл

0,17-ного раствора перексидазы хрена и через 5 мин (можно и через

1636772

5-30 мин) измеряют оптическую плотность растворов при 625 нм на спектрофотометре или при 670 нм на фотоэлектроколориметре КФК-2МП против

5 контроля, содержащего вместо перекиси водорода воду. Содержание Н О в исходной пробе определяют по калибровочному графику по следующей фор муле„ мМ: 10

Dkn

> где n — разведение исходной пробы перед введением в инкубируему смесь, 15

V — - объем вносимой пробы, мл;

D — оптическая плотность раствора против контрольного, не содержащего Н О, k — коэффициент для Н О, находимый из калибровочного опыта (обычно в описанных условиях для фотоэлектроколориметра КФК-2МП он равен 0,35).

Пример 1. Исходную пробу, 25 .одержащую Н О, развели в 100 раз.

Для анализа взяли 0,1 мл. Оптическая плотность фотометрируемого раствора составила 0,210 (ФЭК КФК-2МП, 670 нм, 1 см). Калибровочный коэффициент (т.е. 0 количество микромолей Н О в 4 мл пробы, соответствующей onтйческой плотности 1).для данных условий равен

0,35.

Следовательно, исходная концентра- 35 ция Н 0 равна С = 73,5 мМ.

Пример 2, Анализ перекиси водорода, генерируемой в оксидазной реакции (метод определения активности оксидаз). 40

А. Определение активности алкоголь-. оксидазы. К анализируемой пробе (5100 мкг белка) прибавляют 400 мкл

0,5 М фосфатного буфера, рН 7,0-7,5, 400 мкл 2 мМ гваякола, 400 мкл 2 мМ

45 сульфата n— - аминодиэтиланилина (или дихлоргидрата и-аминодиметиланилина), 400 мкл 100 мМ метанола, объем пробы доводят до 3;8 мл водой. Реакцию начинают прибавлением 200 мкл 0,17-ной пероксндазы хрена ("Реанал" RZ = 0,6) и через 30 с измеряют приращение оптической плотности за 1 мин при 670 нм фотоэлектрокалориметра КФК-2МП в режиме "Активность . Удельную активIf 35 ность фермента (генерируемой перекиси водорода за 1 мин на 1 мг белка) рассчитывают по формуле, мкмоль:

ЬЭ/мин k u

U" С где $ D/ìèí — приращен

Возможно определение перекиси водорода в присутствии гемсодержащих пигментов, в частности гемоглобина крови. ие оптической плотности за 1 мин, п — разведение раствора фермента перед прибавлением реагентов, V — объем рас",âîðà фермента, вводимого в пробу, MJI, С - — исходная концентрация белка, мг/мл, — коэффициент для Н О г находимый из калиброВОЧНЫХ ОПЫТОВ, (В ОПИсанных условиях он равен 0,35).

Исходную пробу бесклеточного экстракта метилотрофных дрожжей, содержащего алкогольоксидазу, развели в

100 раз. Концентрация белка в исходном экстракте 5,5 мг/мл. Для анализа взяли 0,2 мл. Приращение оптической плотности за 1 мин составило

0,125 (ФЭК КФК-2МП, 670 нм; 1 см).

Калибровочный коэффициент в данных условиях равен 0,35. Следовательно, удельная активность алкогольоксидазы в исходном экстракте равна А

= 3 98 мкмоль/мин мг белка.

Б. Определение активности глюкозооксидазы. Анализ и расчет проводят точно так же> как в примере 2А с той лишь разницей, что Вместо метанола испопьзуют 100 мМ глюкозы, а в качестве буфера используют 0,5 N цитрат-NaOH, рН 6,0.

Граничные значения концентрации хромогенов (концентрация H О 50 мкМ) предлагаемого способа сведены в табл.1.

Чувствительность предлагаемого способа повысилась в 2,5 раза.

В табл.2 дано сравнение чувствительности определения перекиси водорода по предлагаемому ме",îäó (хромоген — смесь гваяколы и п-аминодиэтиланилина) и известному (хромоген и-фенилендиамин). Условия: 50 мМ фосфатный буфер, рН ?,О, концентрация хромогенов О,?5 мМ пероксидазы хрена (RZ =- 0,6) 0 05 мг/мл.

Спектрофотометр СФ-26, 1 см.

1636772 концент05-0,5 мИ. а 1 и и-аминодиэтиланилина при рации каждого компонента О, Та блиц

Концентрация гваякоОптическая плотность

Прирост оптической ла и п-аминоконтроля (без На02)

DK диэтиланили10 на, мМ плотно сти, D

"Ы-

Как следует из табл.3, при анализе Н О в пробах, содержащих кровь (гемолизат), с помощью известного способа резко повьппается оптическая плотность холостой пробы (контроля) — до О 510 при разведении кроЭ

15 ви в 100 раз, чторезко ухудщает удобство, точность и чувствительность анализа. В случае применения предлагаемой хромогенной системы (гваякол +

+ n-аминодиэтиланилин) оптическая 20 плотность контроля в присутствии крови в 7,5 раз ниже по сравнению с известной, что связано с неперекрыванием спектров поглощения продукта реакции и гемоглобина.

Таблица 2

52О (и-Фенилещтиамин) D65î (гваякол+

+n-ами н оКонцентрация

Н О, мкМ

30 диэтиланилин) 12,5 0,055

35 25 0,115

50 0,222

75 0,322

100 0,417

0,140

0,288

0,556

0,820

1,080

Таблица 3

1

Серия

Гваякол+в-аминоПр я-аеннлендиамин онцентра ция Н 0, дизтилавиш:и

920 и 0 к ио 04ю (П гО

0 0,013 0,025

25 0,301 0,288 0,440

50 0,569 0 556 0 247

Контроль

Ses добав- 1 ления гемо- 2 лизата

0,115

0,222

0 0,034 0,258

25 0,268 0,234 0,350

50 0,437 0 403 0,413

Контроль

С гемоли- 1 затом (раз- 2 ведение — .

200) 0,092

О, 155

50

0,068

0,250

0,386

С гемоли- Контроль затом (раз- 1 ведение . 2

100) 0,510

0,571

0,64 t

0,061

О, 131

0,182

0,3t8

Влияние гемолизата крови íà определение перекиси водорода по предлагаемому методу (хромоген — смесь гваяколы и п àìèíoäèýòèëàíèëèíà) и

l известному (хромоген — и-фенилендиамин) показано в табл.З. Условия ана-логичны табл.? .

Формула изобретения

Способ определения перекиси водорода в биологических объектах путем добавления к исследуемой пробе буферного раствора., пероксидазы и хромогена, инкубации пробы до прекращения увеличения оптической плотности и спектрофотометрирования, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повьппения чувствительности способа при одновременной возможности осуществления способа в присутствии гемсодержащих пигментов, в качестве хромогена используют смесь гваякола

0,01

0,025

0,05

0,1

0,25

0,375

0,5

0,75

1,0

2,5

О, 005

0,010

0,015

0,028

0,104

0,161

0,272

0,915

1,197

2,102

2,33

0,090

0,447

0,517

0,550

0,560

0,550

0,500

0,412

0,327

0,096

0,064