Способ определения активности интерлейкина 2

 

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для определения активности интерлейкина 2 в плазме крови человека и других биообъектах Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение способа. Цель достигается за счет использования лимфоцитов клеток периферической крови человека, стимулированных фитогемагглютинином в качестве клеток тестсистемы, и дополнительного внесения в систему дексаметазона в концентрации 10 М. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности способа на порядок. 5 табл.

СООЗ СОВЕТСНИХ

РЕСПУБЛИН рц5 G 01 N 33/60

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬП ИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4441338/14 (22) 14.06. 88 (46) 23.04.9 1. Бюл. Р )5 (71) Всесоюзный . онкологический. научный центр АИН СССР (72) Н.Б.Бондарева и А.В.Полоцкая (53) 612.015(088.8) (56) J. of Immunology, 1978, v, 120, р. 2027-2032, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ИНТЕРЛЕЙКИНА 2 (57) Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использоИзобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для определения актинвости интерлейкина 2 в плазме крови здоровых людей и онкологических больных после гормоно- и химиотерапии, а также в исследовательской практике для определения наличия интерлейкина 2 в оцениваемых образцах.

Цель изобретения - упрощение способа при одновременном повышении чувствительности. ,Способ осуществляется следующим образом.

Выделяют лимфоциты из периферической крови (ЛПК) человека, суспендируют их в стандартной среде для культивирования лимфоцитов в концентрации 1-5 ° 10 клеток в 1 мл, В лунки

96-луночных стандартных плоскодонных пластин вносят клеточную суспензию .ЛПК. К части проб добавляют фитогемагглютинин (ФГА), дексаметаэон (ДМ), „„SU„„1644036 A1 вано для определения активности интерлейкина 2 в плазме крови человека и других биообъектах. Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение способа. Цель достигается за счет использования лимфоцитов клеток периферической крови человека, стимулированных фитогемагглютинином в качестве клеток тестсистемы, и дополнительного внесения в систему дексаметазона в концентрации 10 М. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности способа на порядок. 5 табл. исследуемые образцы с интерлейкином 2.

Клетки инкубируют в течение 72 ч при 37 С и 57 СО, за 6 ч до окончания 2 инкубации во все лунки добавляют по

1 мкКю радиоактивного предшественни- д ка. Клетки собирают на фильтры, высушивают, просчитывают радиоактивную метку.

Наличие интерлейкина 2 в препара- С те определяют следующим образом. 4Ь

3а 100Х принимают значение сртколичество импульсов в 1 мин, которое дают РГА — стимулированные димфоциты. Процент опыта подсчитывают относительно значения cpm ФГА — стимулированных лимфоцитов. Активным считают тот препарат интерлейкина 2, который усиливает пролиферацию по сравнению с лимфоцитами, обработанными гормоном, подавляющим пролиферацию ФГАстимулированных ЛПК. имеет активность 350 ед. Препарат 2 ° повышающий пролиферацию ФГА — стимулированных лимфоцитов, обработанных

ДМ, до 837 имеет активность 600 ед.

Все остальные варианты опытов, указанные в табл, 1-4, являются контрольными,- Вариант 1 (клеткн + этанол) показывает пролиферацию клеток в условиях опыта (дексаметазон растворен в этаноле). Вариант 2 показывает действие гормона на нестимулированные лимфоциты. Вариант 4 (клетки +

1ФГА + ДМ) показывает действие гормона на ФГА » стимулированные лимфоциты (28,5, 28 и Зб — подавление пролиферации).

По отношению к варианту 4 рассматривается действие исследуемого образца: в случае активного препарата процент опыта должен быть вьппе контрольного варианта 4 (51 против 28,57 в табл. 1, 94 и 97 против 287 в табл. 2, 69 и 837. против Зб в таблице 3) .

Варианты 5 и 6 (также контрольные) показывают действие исследуемого образца на нестимулированные и ФГА на стимулированные лимфоциты, В табл. 5 приводятся результаты типичного опыта по тестированию на активность интерлейкина 2 в плазме онкологического . больного. Плазма получена при плазмофорезе, и центрифугирована при 2000 об/мин в течение

30 мин при 4 С, Таким образом, усиление пролиферации клеток образцом по сравнению с

ФГА стимулированными лимфоцитами, обработанными гормонами, свидетельствует о наличии в образце плазмы крови активного интерлейкина 2.

Для анализа пробы, известным способом необходимо внесение достаточно большого количества образца (100300 мкл), для анализа пробы предлагаемым способом требуется не более

15 мкл исследуемого препарата, чувствительность при этом возрастает на порядок.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность и упростить способ определения активности интерлейкина 2 за счет известному способу), Формула изобретения

Способ определения активности интерлейкина 2, включающий культивиро3 1644036 а

Для теста необходимо 3-15 мкл ис следуемого образца.

П у и м е р. Из периферической крови человека выделяют лимфоциты и суспендируют их в среде RPME — 1640, содержащей 107 ТЗС 2 10 K L-глютамина, 10 мМ HEPES и 100 ед. пеницил-, лина и 100 мкг стрептомицина на 1мл среды концентрации 1-5 ° 10 клеток

s 1мл.

В каждую лунку 96-луночных плоскодонных пластин вносят по 200 мкл подготовленной клеточной суспензии.

ДМ (5 ° 10 4M Sigma) разводят

967.-ным этанолом, конечная концентрация 10 М, ФГА используют в стандартной концентрации, применяемой для реакции бластотрансформации лимфоцитов.

В определенной последовательности (ФГА, итерлейкин 2, ДМ нли спирт) добавляют реагенты в необходимые лунки по схеме: клетки + 2 мкл этанола;

25 клетки + 2 мкл ДМ; клетки + 2 мкл ФГА; клетки + 2 мкл ФГА + 2 мкл ДМ; клетки + 1-5 мкл образца; клетки +.2 мкл ФГА + 1-5 мкл об-.

30 раэца; клетки + 2 мкл ФГА,+ 1-5 мкл об, разца + 2 мкл ДМ.

Тестирование проводят. в 2-3 параллельных пробах, Клетки инкубируют в течение 72 ч при 37 С и 5 СО,. За 6 ч до окончания инкубации s каждую лунку добавляют

1 мкКю метил- Н-тимидина. Клетки со» в бирают на фильтры из стекловолокна типа GF»»C с помощью прибора для полу40 автоматического сбора клеток (Cell

Harvester, Flow).

Фильтры высушивают и помещают во флаконы содержащие 5 мл сцинтилля45 циониой жидкости (4,0 r PPO и 0,2 r, POPOP в 1 л толуола). Радиометрию. образцов проводят в жидкостном сцинтилляционном -счетчике, определяя количество импульсов в 1 мин (cpm), Результаты опыта представлены в табл. 1-3.

По данным табл. 1 и 2 можно построить калибровочный график (табл. 4).

Тогда количество интерлейкина 2 в пре-. исключения культуры клеток CTLL (по парате можно выразить в единицах активности. Так препарат 1, повьппающий ! пролиферацию ФГА — стимулированных лимфоцитов, обработанных ДМ, до.697.

1644036

Таблица

Вар ант

Реагент срш

Значение соответствует 100Х М М

Значение соответствует 28,5Х ° "" Значение соответствует 51Х..

Таблица 2

Вари- Реагент ант

cpm

9050+715

6790+720

400254+87765

111358+31981

Клетки + этанол

Клетки + ДМ

Клетки + ФГА

Клетки + ФГА + ДМ

Клетки + образец:

1000 ед

2500 ед

Клетки + ФГА + образец:

1000 ед.

2500 ед, Клетки + ФГА + образец:

1000 ед.

2500 ед, + ДМ

31163 43122

36360+5788

399319й2234

379747+33039

374359+57705

388895 6005» Значение

%+

Значение значение

;ИМ%

Значение соответствует 100Х. соответствует 28Х. соответствует 94Х. соответствует 97Х.

Таблица 3

Ва ан

13766+2183

1702л281

167 701+ 7121

60878 9823

Клетки + этанол

Клетки + ДМ

Клетки +,ФГА

Клетки + ФГА + ДМ

Клетки + образец: препарат 1 препарат 2

12116+1508

17539 947 ванне клеток, вьщеление контрольного и опытного образцов, добавление в опытный образец пробы с интерлейки

3 ном внесение в оба образца метил- Нt

5 тимидина, определения содержания интерлейкина 2 по уровню радиоактивности B опытном образце в сравнении с контрольным, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа при одновременном повьппении чувствительности, s качестве клеток используют свежевьщеленные лимфоциты периферической крови человека, стимулированные фитогемагглютинином, а в опытный образец, содержащий интерлейкин, дополнительно вносят декса-6 метазон в концентрации 10 M.

Клетки + этанол 7741МОЗ

Клетки + ДМ 4671 608

Клетки + ФГА 384182 1 1546

Клетки + ФГА + ДМ 109493 8251

Клетки + образец 10038+928

Клетки + ФГА + образец 234058 25470

Клетки + ФГА + образец + ДМ 196392+984

1644036

П о олжение табл.3

Клетки + ФГА + обраэец: препарат 1 1706564.39380 препарат 2 131863Й26238

Клетки + ФГА + об раэец: препарат 1 1157.18 20990 препарат 2 + ДМ 139642Ы893»

Значение соответствует 100%.

Значение соответствует ЗОХ. " Значение соответствует 69Х.

+ и "Значение соответствует 83Х.

Таблица 4

Таблица5.

Вари- Реагент ант .с

Активность интерлейкина 2, Х от контроля

cpm

1000

51Х

69Х

83Х

94Х

Составитель Н.Гуляева

Редактор Н.Гунько Техред Л.Олийнык Корректор Л Вескид

Закаэ 1237 Тираж 416 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по иэобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-иэдательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 тивность интерлей20 на 2, ед. активсти стандартного препарата

1 Клетки 5239 280

2 Клетки + ДМ 4042 554

3 Клетки + ФГА 113718 3243

4 Клетки + ФГА + ДМ 83467+5980 5 Клетки + ФГА + об раэец + ДМ 110834й2433