Способ определения иммунодефицитных состояний

 

Изобретение относится к медицине и может использоваться в клинической иммунологии для оценки иммунного статуса больных и при проведении диспансеризации населения. Целью изобретения является упрощение и повышение точности анализа . Способ определения иммунодефицитных состояний заключается в определении уровня экспрессии рецепторов к факторам роста (интерлейкинам) на поверхности иммунокомпетентных клеток с помощью хемилюминесцетного метода. Мононуклеарные клетки из периферической крови человека культивируют в течение 16-18 ч в присутствии митогена, затем определяют уровень активации этих клеток экзогенными интерлейкинами по сравнению с уровнем спонтанной хемилюминесценции в суспензии клеток в присутствии пюминола. При иммунодефицитных состояниях отмечают резкое снижение активации хемилюминесценции интерлейкинами 1 и 2 (для интерлейкина-1 18,5% и ниже, для интерлейкина-2 17% и ниже). W fe

союз соВетских социАлистических

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4695450/14 (22) 16.03.89 (46) 07.06.91. Бюл, ¹ 21 (71) 2-й Московский государственный медицинский институт им. Н.И.Пирогова (72) Л.B.Êoâàëü÷óê, Л.Г.Коркина, А.С.Павлюк, Н.В,Заречнева, Т,Ю.Ульянова и

А,А.Константинов (53) 615,375 (088.8) (56) Frezenius Z Annal. Chem. 1982, Bd 311.

N. 4, 354. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОДЕФИЦИТНЫХ СОСТОЯНИЙ (57) Изобретение относится к медицине и может использоваться в клинической иммунологии для оценки иммунного статуса больных и при проведении диспансеризации населения. Целью изобретения являетИзобретение относится к медицине и может быть применено как лабораторный метод определения иммунологического статуса больного.

Цель изобретения — упрощение и повышение точности способа за счет определения иммунодефицитных состояний, основанный на оценке экспрессии рецепторов к факторам роста (интерлейкинам) на клеточной мембране.

Способ осуществляется следующим об.разом.

Мононуклеарные клетки из венозной периферической крови, забранной стерильно из локтевой вены и гепаринизированной (10-25 ЕД/мл крови) выделяют центрифугированием на градиенте плотности фиколл... )Ц,, 1654748 А1

2 ся упрощение и повышение точности анализа. Способ определения иммунодефицитных состояний заключается в определении уровня экспрессии рецепторов к факторам роста (интерлейкинвм) на поверхности иммунокомпетентных клеток с помощью хемилюминесцетного метода, Мононуклеарные клетки из периферической крови человека культивируют в течение 16 — 18 ч в присутствии митогена, затем определяют уровень активации этих клеток экзогенными интерлейкинами по сравнению с уровнем спонтанной хемилюминесценции в суспензии клеток в присутствии люминола, При иммунодефицитных состояниях отмечают резкое снижение активации хемилюминесценции интерлейкинами 1 и 2 (для интерлейкина-1

18,5ф и ниже, для интерлейкина-2 17 и ниже). верографина по методу Boym. Мононукле- (Л арные клетки культивируют в среде ¹ 199 ф (Ин-т полиомиелита и вирусного энцефалита) в концентрации 1-2 х 10 мл с ФГА или

КОН-А (нСэрва", ФРГ) в дозе 5-10 мкг/мл при 37 С в течение 14 — 16 ч в центрифужных пробирках. После культивирования клетки центрифугировали при БОО C. Надосадок удаляли и клетки ресуспендирОвали вб,т мл в среды № 199. Суспензию клеток переносили в кювету, содержащую 0,8 мл среды инкубации следующегосостава: 110 мМ NaCI, 5 мМ глюкозы, 2,5 мМ М9С!2ь 0,65 мМ люминала, 10 мМ трис НО, рН = 7,4. Определяли уровень спонтанной хемилюминесценции с помощью люминометра (ЛКБ, Швеция). Не нарушая светоизоляции системы, в кювету

1654748

10

35

50 добавляли 0,1 мл среды, содержащей интерлейкин-1 или интерлейкин-2, и определяли уровень активированной хемилюминесценции. Вычисляли отношение величин ак1а

1сп тивированной и спонтанной хемилюминесцении (индекс активации), Индексы активации, характерные для здоровых доноров и для больных с иммунопатологическими состояниями подтверждают изобретение. Иммунодефицитные состояния были, диагносцированы известным способом. . Интерлейкин-1 и интерлейкин-2 получали иэ среды культивации мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров. Мононуклеарные клетки разделяли на прилипающие и неприлипающие к стеклу культивацией в пенициллиновых флаконах в концентрации 2-4х10 /мл с 20%-ной эмбриональной телячьей сыворотки при

37 С в течение 45 — 60 мин. Неприлипшие клетки переносили в новые флаконы. Прилипшие клетки снимали холодным раствором Версена (4 — 6 С), центрифугировали и ресуспендировали в среде № 109. Для получения среды, содержащей интерлейкин-1, прилипающие клетки культивировали в концентрации 0,2 — 0,4х10 /мл в среде N 199 с

10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки. Через 72 ч надосадак собирали и хранили при — 20 С. Для получения супернатанта, содержащего интерлейкин-2, неприлипающие клетки в концентрации 1х10 /мл культивировали в среде ¹ 199 с 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки и с

10 мкг/мл ФГА. Через 72 ч надосадок собирали и хранили при — 20 С. При выполнении способа возможно использование коммерческих препаратов интерлейкина-1 или инте рлей ки на-2.

Пример 1. Больной Б., 36 лет поступил в отделение рекоструктивной хирургии глаза ВНИИ ГБ МЗ СССР с жалобами на жгучие боли в правом глазу,-светобоязнь и ухудшение зрения. При обследовании было выявлено, что роговица инфильтрирована, прозрачность нарушена, имеется множество пузырьков высыпаний. Был диагностирован герпетический кератоувеит в стадии обострения заболевания, На основании длительного рецидивирующего течения заболевания было сделано предположение, что у больного имеет место иммунодефицитное состояние, усугубляющее течение заболевания.

Для параллельного проведения оценки экспрессии рецепторов к интерлейкинам у больного была забрана кровь. При использовании предлагаемого способа по снижению индекса активации хемилюминесценции интерлейкином-1 до 10,2 %, интерлейкином-2 до 9,10% было диагностировано им-" мунодефицитное состояние через 18 ч после забора крови. Через 80 ч эти данные были подтверждены с помощью известного способа оценки экспрессии рецепторов к интерлейкинам.

Пример 2. Больной И., 26 лет, поступил в радиологическое отделение МНИ РРИ с жалобами на опухолевидные образования в области шеи, лихорадку, плохое самочувствие. При объективном обследовании в области шеи, подмышечных впадин пальпируются уплотненные пакеты лимфоузлов. При биопсии обнаружены клетки Березовского—

Штернберга, йа основании чего был поставлен диагноз лимфогранулематоза. Для оценки экспрессии рецепторов к интерлейкинам у больного была забрана кровь. При использовании данного способа у больного было диагностировано иммунодефицитное состояние по снижению индекса активации хемилюминесценции до 15% для интерлейкина-1 и до 17% для интерлейкина-2. Результаты были получены через 18 ч после забора крови. Полученные результаты были подтверждены с помощью известного способа через 80 ч после взятия крови. Таким образом; диагностика иммунодефицитного состояния была сокращена на 62 ч.

П р им е р 3. Больной Г.,6 лет, находился на лечении в детской клинической больнице

¹ 10 г, Москвы. Жалоб не предьявлял. Объективно — признаки болезни Дауна. Поступил по поводу длительной вялотекущей болезни верхних дыхательных путей. При оценке экспрессии рецепторов к интерлейкинам у больного было диагностировано иммунодефицитное состояние. При параллельной оценке экспресии рецепторов предлагаемым способом было также диагностировано иммунодефицитное состояние по снижению индекса активации хемилюминесценции интерлейкином-1 до 18,5%, интерлейкином-2 до 14,2%. Срок диагностики был также сокращен на 62 ч.

Таким образом, предлагаемый способ обладает рядом преимуществ по сравнению с известным ранее способом диагностики иммунодефицитных состояний: меньшей трудоемкостью и длительностью (сокращение срока постановки диагноза на 62 ч), высокой точностью и воспроизводимостью (значение индекса активации, вычисленное по данным хемилюминесцентного метода, колеблется в пределах 2 — 5% в пяти параллельных пробах), отсутствием необходимости дорогостоящих меченых реактивов, прогрессивностью (использование современного высокочувствительного метода биофизического анализа).

1654748

Формула. изобретения

Составитель П.Бонарцев

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор С.Черни, Редактор В.Данко

Заказ 1948 Тираж 420 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Способ определения иммунодефицитных состояний путем активации мононуклеарных клеток крови с помощью интерлейкина-1 или интерлейкина-2 с последующей оценкой митогенного действия на клетки, отличающийся тем, что. с целью упрощения и повышения точности способа, дополнительно леред активацией интерлейкинами мононуклеарные клетки культивируют 16-18 ч в присутствии митогенэ, далее сравнивают уровень активации митогенами

5 и интерлейкинами с помощью хемилюминесценции и при снижении хемилюминесценции с интерлейкином-1 до 18,5$ и ниже и интерлейкином-2 до 17 и ниже определяют иммунодефицитное состояние, 10