Штамм бактерий асinетовастеr саlсоасетiсus продуцент рестриктазы аса 1

 

Изобретение хранится во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ генетика под коллекционным номером ВКПМ В-4721, получен в результате систематического поиска штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции в природных условиях. При культивировании штамма на питательной среде при 25°С в термостатированных качалках до достижения логарифмической фазы роста получают урожай клеток, из которых после дезинтеграции ультразвуком и хроматографических очисток получают фермент Аса 1, способный узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5<SP POS="POST">Ъ</SP> - CCAN<SB POS="POST">5</SB>TGG -3<SP POS="POST">Ъ</SP>. ВЫХОД ФЕРМЕНТА 1060 ЕД/Г, АКТИВНОСТЬ 5000 ЕД/МЛ. ШТАММ ИСПОЛЬЗУЕТСЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫ, КОТОРУЮ ПРИМЕНЯЮТ В ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ ДЛЯ СОЗДАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ МОЛЕКУЛ И ДЛЯ ФИЗИЧЕСКОГО КАРТИРОВАНИЯ МОЛЕКУЛ ДНК.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st)s С 12 N 9/14, 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4724725/13 (22) 27.07.89 (46) 07.07.91. Бюл, ¹ 25 (71) Научно-производственное объединение

"Вектор" и Лимнологический институт СО

AH СССР (72) В.С.Дедков, С.X.Äåãòÿðåâ, Н.И.Речкунова, В,Е.Репин, В.А.Верхозина и T.Ï.Виноградова (53) 663. 15(088.8) (56) Kita К. et. al. Nucl. Acids Res. 1985, ч.13, р. 8685-8694.

Catalog Biolabs, 1986/1.987. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ACINETOBACTER .CALCOACETlCUS — ПРОДУЦЕНТ Р1=.СТРИКТАЗЫ АСА I (57) Изобретение хранится во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизI

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и представляет собой штамм, и родуцирующий сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 -CCAN5TGG-3 .

Рестриктаза данной специфичности. может быть использована для работ по клонированию, физическому картированию генов, а также является удобной моделью для изучения механизмов белокнуклеиновых взаимодействий.

Целью изобретения является выявление штамма-продуцента, синтезирующего одну сайт-специфическую рестриктазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 -CCAN5TCC-3 .

Новый штамм Acinetobacter

calcoaceticus — продуцент рестриктазы Аса

„„5Q „„1661212 мов ВНИИ генетика под коллекционным номером ВКПМ В-4721, получен в результате систематического поиска штаммов-продуцентов эндонуклеаэ рестрикции в природных условиях. При культивировании штамма на питательной среде при 25 С в термостатированных качалках до достижения логарифмической фазы роста получают урожай клеток, из которых после дезинтеграции ультразвуком и хроматографических очисток получают фермент Аса 1, способный узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 -CCAN5TGG-3 . Выход фермента 1060 ед,/г, активность 5000 ед./мл.

Штамм используется для получения рестриктаэы, которую применяют в генетической инженерии для создания рекомбинантных молекул и для физического картирования молекул ДН К.

I выделен в результате систематического поиска штаммов-продуцентов рестриктаз в пресной воде методом скрининга и хранится во Всесоюзной коллекции промышлен- 0 ных микроорганизмов института ВНИИ генетика, коллекционный номер ВКПМ В4721. each

Штамм А.calcoaceticus ВКПМ В-4721 ха- с ) ратериэуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки кокковидные. в основном расположены парами 0.5 — 0,8 мкм. грамотрицательные. На МПА образуют средние, блестящие, выпуклые колонии с ровными краями. На синтетической среде с ацетатом образуют мелкие беловатые колонии.

Физиологические признаки.

Хемоорганотроф. Аэроб, каталазоположительный, оксидазоотрицательный. Не да1661212 ет роста при замене ацетата глюкозой и/или маннитом, Нет роста на безазотистой среде Эшби с глюкозой, маннитом и ацетатом, Глюкозу не окисляет и не сбражйвает.

Сероводород не образует. Индолотрицатель- 5 ный, Устойчив к ампициллину, хлорамфениколу, чувствителен к тетрациклину, канамицину, стрептомицину. Доля GC в

ДНК-42 (по плавучей плотности).

Культуральные признаки. 10

Дает рост на МПА, при температурном диапазоне от 5 до 30 С. Оптимальная температура 25 С. Оптимальный рН 7. Растет при 0,5 — 3% NaCI. Оптимальная для роста 0,6 NaCI. Требователен к аэрации. 15

Хранение осуществляют под вазелиновым маслом в 30%-ном глицерине при 70 С.

Пример 1. Получение биомассы и выделение;зестриктазы, Ночную культуру штамма 20

A.calcoaceticus засевают в свежую питательную среду, состоящую из 10 г/л триптона ("0ifco"); 5 г/л дрожжевого экстракта ("Serva"); 6 г/л NaCI; остальное вода. Культивируют при 25 С в термостатированной 25 качалке в двухлитровых колбах с 200 мл питательной среды при 200 об/мин до достижения логарифмической фазы роста, Клетки осаждают центрифугированием при

4 С. 10 r клеток суспендируют в 30 мл 0,02 30

M трис-HCI буфере, рН 7,5, содержащем

1х10 М P меркаптоэтанол и О, трион

Х-100, и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием (1200xg, 30 мин), 35 надосадочную жидкость наносят на колонку с биогелем А 0,5 rn (Bio-Rad), объемом 500 мл, уравновешенную 0,02 M калийфосфатным буфером, рН 7,5, содержащим 1x10 M

Р-меркаптоэтанол; 5х10 ЭДТА; 0,8 М NaCI; 40

0,1 тритон Х-1,00, (буфер А). Фермент элюируют тем же буфером со скоростью 20 мл/ч, Фракции объемом 10 мл собирают и анализируют на присутствие активного фермента. Фракции, содержащие рестриктаз- 45 ную активность, объединяют и диализуют против 2 л 0,02 M калийфосфатного буфера, рН 7,5, содержащего 1х10 М P -меркаптоэтанол и 5х10 M ЭДТА (буфер В). меняя буфер дважды. Диализат наносят на колон- 50 ку объемом 30 мл с ДЕАЕ-целлюлозой (DE52, Whatrnan), урановешенную буфером В.

Колонку промывают буфером В и адсорбированный фермент элюируют 300 мл градиента NaCI (0-1 М) в буфере В. Фракции, элюируемые при 0,2-0,3 М NaCI, содержащие рестриктаэу, объединяют и диализуют против 2 л буфера В. Фермент после диализа наносят на колонку с фосфоцеллюлозой (Р-ll, Whatman) объемом 10 мл, уравновешенную буфером В, и промывают колонку тем же буфером. Элюцию фермента проводят 200 мл градиента NaCI 0,0 — 1 М в буфере

В. Фракции, содержащие рестриктазу, эл юируемые при 0,53 — 0,6 М NaCI, объединяют и диализуют против буфера В, содержащего

0,1 М NaCI и 50 -ный глицерин.

Пример 2. Определение специфичности и активности фермента.

Специфичность фермента определяют по картине совместного и параллельного гидролиза субстратной ДНК, Идентичность картин гидролиза указывает, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов

5 -CCANgTGG-3 .

Выход фермента Аса 1 определяют по электрофоретической картине гидролизэ

ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага в течение 1 ч при 37 С.

Выход фермента составляет 1000 ед./г, активность 5000 ед./мл.

Предложенный штамм-продуцент является уникальным. Впервые в роде

Acinetobacter найден продуцент рестриктазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов

5 -CC©NsTGG-3

Культивирование предлагаемого штамма является простой и воспроизводимой процедурой, не требующей дорогостоящего оборудования. Полученный штамм позволя.ет получать рестриктазу с выходом не менее

1000 ед,/г сырой биомассы, пополнив ассортимент рестриктаз, выпускаемых отечественной промышленностью.

Формула изобретения

Штамм бактерий Acinetobacter

calcoaceticus ВКПМ В-4721 — продуцент рестриктазы Аса 1,