Способ определения содержания сфингомиелина в биологических жидкостях

 

Изобретение относится к биологической химии и медицине. Цель изобретения - упрощение способа. Цель достигается гидролизом упаренного липидного экстракта 0,1 - 0,2 N NAOH в метаноле в течение 0,5 - 4 ч, удалением продуктов гидролиза путем встряхивания с водой и хлороформом с последующим измерением содержания сфингомиелина. Сравнение способа со способом двухмерной тонкослойной хроматографии показало его высокую точность - 98 - 99%. Способ позволяет проводить определение уровня сфингомиелина без использования дорогостоящего оборудования и реактивов, что дает возможность использования его как в биохимической практике, так и в медицине при диагностике респираторного дистресс-синдрома новорожденных. 5 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)л 6 01 N 33/68

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) "4645680/14 (22) 30,12.88 (46) 15.07.91. Бюл. ¹ 26 (71) Научно-исследовательский институт физико-химической медицины М3 РСФСР (72) T È. Торховская, M.Â. Шингирей, Э.M. Халилов, Ю.Д, Балика, В,И. Кулаков, Л.П, Лисова, Р.Д. Сеитова и Л,Д, Бергельсон (53) 612.015(088.8) (56) Кейтс M. Техника липидологии. М., 1979, с, 322. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ СФИНГОМИЕЛ IHA В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ (57) Изобретение относится к биологической химии и медицине, Цель изобретеИзобретение относится к биологической химии, а именно к способам определения концентрации фосфолипида сфингомиелина, и может быть использовано для,антенатальной диагностики развития респираторного дистресс-синдрома (РДС) у новорожденных, когда для определения степени зрелости легких плода измеряется отношение Лецитин (сфингомиелин или глицерофосфатиды) — сфингомиелин в амниотической жидкости. Кроме того, способ может быть использован в биохимических исследованиях, связанных с диагностикой и патогенезом различных нарушений липидного обмена.

Цель изобретения -упрощение способа при массовых анализах за счет сокращения стадий, „„5UÄÄ 1663554 А1 ния — упрощение способа. Цел ь достигается гидролизом упаренного липидного экстракта 0,1 — 0,2 н,NaOHa метаноле в течение 0,5—

4 ч, удалейием продуктов гидролиза путем встряхивания с водой и хлороформом с последующим измерением содержания сфингомиелина, Сравнение способа со способом двухмерной тонкослойной хроматографии показало его высокую точность — 98 — 99;4.

Способ позволяет проводить определение уровня сфингомиелина без использования дорогостоящего оборудования и реактивов, что дает возможность использования

его как вбиохимической практике, так и в медицине при диагностике респираторного дистресс-синдрома новорожденных.

5 табл, Цель достигается тем, что упаренный в вакууме липидный экстракт, соответствующий 0,5 мл сыворотки крови или 1,5 мл амниотической жидкости подвергают мягкому Q щелочному гидролизу 0,1 — 0,2 н,NaOH в ме. таноле в течение 0,5 — 4,0 ч, после чего npo- ( дукты гидролиза разделяют путем

,/ встряхивания в смеси с водой с хлорофор- у мом с последующим отстаиванием. При, р этом в водную фазу уходят продукты гидролиза глицерофосфатидов, а устойчивый к щелочному гидролизу сфингомиелин остается в нижней органической фазе. После разделения фаз количество сфингомиелина определяют с помощью любого метода определения фосфолипидов. Упаривание липидного экстракта осуществляют в вакууме при 40-50 С, гидролиз проводят при концентрации NaOH (0,1 — 0,2 н, вместо 1н.в известном способе), при несколько большей

1663554 температуре, 42 — 48 С, Для разделения продуктов гидролиза используют хлороформы — метанол — вода в соотношении (2:1;0,6).

Пример 1. Определение содержания сфингомиелина в амниотической жидкости, 1,5 мл амниотической жидкости помещают в три обьема смеси хлороформ:метанол (2;1) и экстрагируют липиды, Экстракт липидов концентрируют путем упаривания в вакууме при 45 С (на роторном испарителе или в колбе с нисходя;цим холодильником) или в широкой пробирке на водяной бане при

50 — 60 С небольшими порциями, затем переносят в пробирки, снабженные завинчивающимися крышками с прокладками типа

"Pyrex" США и быстро упаривают досуха на водяной бане (гидролиз можно проводить в колбе с обратным холодильником), Осадок липидов растворяют в 2,0 мл метанола, добавляют 0,2 мл 1н. водного

NaOH и инкубируют на водяной бане при

45 С 2 ч с периодическим встряхиванием, После гидролиза в пробирку добавляют 4 мл хлороформа и 1,2 мл воды (соотношение хлороформ:метанол:вода взято согласно

Фолчу), пробирку энергично встряхивают и после отстаивания отделяют нижнюю фазу.

Параллельно равные аликвоты липидного экстракта используют для определения сфингомиелина по известному способу, а также при помощи ТСХ (прототип).

Для проверки полноты гидролиза глицерофосфатидов после гидролиза по предлагаемому способу из содержащей сфингомиелин нижней фазы следовые количества (2 — 3 мкл) наносят на пластинку с тонким слоем силикагеля и хроматографируют в системе хлороформ:метанол:вода 65:25:4, При этом экстракт после гидролиза по предлагаемому методу содержит только одно пятно сфингомиелина, в то время как после гидролиза по известному способу над пятном сфингомиелина было отчетливое пятно лецитина, составляющее до 50% от исходного его содержания. Это указывало на неполное расщепление лецитина в процессе гидролиза в условиях известного способа, Для определения количества непрогидролизовавшихся фосфолипидов,нижнюю

<Ьазч после гидролиза согласно обоим способам переносят количественно в огнеупорные пробирки, упаривают растворитель досуха на водяной бане и определяют содержание фосфолипидов, Параллельно проводят то же определение для содержащей сфингомиелин эоны силикагеля после ТСХ, Результаты приведены в табл. 1.

Как видно иэ табл. 1, результаты определения сфингомиелина согласно предлага5

10 ся фосфолипиды, как в примере 1, с параллельным определением сфингомиели30 на обычным методом с использованием

ТСХ обобщены в табл. 4

50 емому способу почти совпадают с полученными при помощи классического способа с использованием ТСХ (расхождение 2 — 5 (), в то время как определение согласно известному способу дает грубое завышение (в

1,2 — 2,2 раза) за счет неполного гидролиза глицерофосфатидов.

С целью расчета точности предлагаемого способа проводят опредение сфингомиелина согласно этому способу в амниотической жидкости 55 женщин при сроке беременности 28 — 40 нед.

Результаты приведены в табл. 2.

Приведенные результаты статистически подтверждают отсутствие различий в определении сфингомиелина с. помощью точного, но громоздкого метода, использующего ТСХ, и предлагаемого гидролитическоro способа.

Пример 2. Определение содержания сфингомиелина в сыворотке крови.

0,05 мл сыворотки крови добавляют к 10 мл хлороформа-метанола (2:1) и экстрагируют липиды.

Экстракт упаривают, подвергают гидролизу и определяют непрогидролизовавшиеРезультаты приведены в табл. 3.

Как видно из табл, 3, результаты определения содержания сфингомиелина в сыворотке крови по предлагаемому способу хорошо воспроизводимы и совпадают с полученными по классическому способу с использованием ТСХ. Таким образом, предлагаемый способ пригоден для определения содержания сфингомиелина и в сыворотке крови, Пример 3. Изменение условий гидролиза.

Из 0,5 мл сыворотки крови с известным содержанием сфингомиелина (49 мг/дл), определенным предварительно. с помощью

ТСХ, экстрагируют липиды и обрабатывают экстракт, как в примере 1. Гидролиэ.осуществляют, изменяя концентрацию NaOH, время и температуру, после чего в каждом случае проводят обработку реакционной смеси, как в примере 1, с последующим определением непрогидролизовавшихся фосфолипидов известным методом. Результаты

Из табл. 4 видно, что правильные результаты, т,е, близкие к результатам, полученным при помощи ТСХ, удается получить при использовании концентрации щелочи в процессе гидролиза не ниже 0,1 н, а температуры гидролиза не ниже 42 С и не выше

1663554

Таким образом, предлагаемый способ позволяет проводить определение уровня сфингомиелина с помощью мягкого щелоч5 ного гидролиза в отработанных условиях не только в амниотической жидкости, но также и в сыворотке крови и, возможно, в других биологических препаратах. Метод информативен и точен, в сочетании с простотой вы10 полнения не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, что создает возможность для широкого внедрения его в повседневную клиническую практику, в частности для антенатального определения

15 степени зрелости легких плода и прогнозирования развития респираторного дистресс-синдрома у новорожденных.

Формула изобретения

20 Способ определения содержания сфингомиелина в биологических жидкостях путем экстракции липигов хлороформ-метанольной смесью, вакуумного упаривания экстракта, растворения его в органическом

25 растворителе с последующим фракционированием и измерением, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что, с целью упрощения способа при массовых анализах за счет сокращения стадий, экстракт растворяют в метаноле, до30 бавляют к нему 0,1 — 0,2 í.NaOH и инкубируют 05 4 ч при 42 48С, затем полученному гидролизату липидов добавляют хлороформ и воду при объемном соотношении хлороформ:метанол в гидро35 лизате:вода 2:1:0,6, смесь встряхивают, отбирают нижнюю фазу с последующим нанесением пробы на пластину и измерением.

Таблица 1

Концентрация сфингомиелина в амниотической жидкости, / е нная и тем

Известный способ

ТСХ

Предлагаемый способ ги олиэа в метаноле

10,4

7,2

4,0

2,1

8,9

15,2

13,0

5,5

4,4

10,3

10,2

7,0

3,8

2,0

8,7

1,9

2,8

5,2

5,0

2,2

49

44,7

Таблица 2

Кон ент а ия с ингомиелина в амниотический жи кости, мг/л

П е лагаемый способ

7,25 1,25

Классический способ с ТСХ

68 - 075

> 0,05

48 С. При более низких значениях концентрации NaOH и температуры (опыты 1 и 8) гидролиз глицерофосфатидов неполный, что проявляется в завышении результата определения сфингомиелина. При превышении указанного значения температуры (опыт 12), напротив, результаты занижены вследствие частичного разложения сфингомиелина (СФ).

Пример 4. Изменение условий гидролиза.амниотической жидкости.

1,5 мл амниотической жидкости зкстрагируют, как в примере 1. Проводят гидролиз упаренного экстракта липидов, согласно примеру 1 при 15 С, меняя время гидролиза и повышая концентрацию NaOH. Результаты определения непрогидролизовавшихся фосфолипидов приведены в табл, 5.

Как видно из табл. 5, количество непрогидролиэовавшихся фосфатидов соответствует содержанию сфингомиелина при концентрации NaOH не ниже 0,1 и не выше

0,2 н. При более низкой концентрации

NaOH (в более мягких условиях опыт 1) результаты завышены вследствие неполного гидролиза, а при более выооких занижены (опыт 4) ввиду некоторого разрушения сфингомиелина, В отношении времени гидролиза иэ табл. 5 видно, что верные результаты получаются при продолжительности опыта от

0,5 до 4 ч. Увеличение продолжительности гидролиза свыше 5 ч и уменьшение времени (0,5 ч и ниже) также приводят к искажению результатов или ввиду неполного гидролиза (опыт 5) или вследствие некоторого разрушения определяемого вещества — сфингомиелина (опыт 14).

0,1 н. NaOH, 2 1 í, NaOH, 15, ч, 45 С (пред-,минут, 37 С лагаемый ) прототип ) Ошибка по -равнению с ТСХ, Я, 1663554

Таблица b

¹ образца ам ниотиче-. ской жидко сти

Концентрация непрогидролизовавшихся фосфолипидов (СФ ), мг/л

Время, ч

Клнечная концентрация NaOH, Истинная концентрация СФ, определенная путем

ТСХ, мг/л

Составитель А, Агуреев

Редактор О. Спесивых Техред M,Моргентал- Корректор T. Палий

Заказ 2264 Тираж 418 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.,4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r, Ужгород, ул,Гагарина, 101

3

6

8

11

12

13

0,05

0,1

0,2

0,4

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1.

2

2

0,25

0,5

2

2

4

12

10,7

10,7

33

12,5

12,5

12,5

5,7

11

11.

11

11

12,3

12,3

12,3

12,3

15,2 .

15,2

4

5,8

5,8

% концентра ции непрогидpoflизова В шихся фосфолипидов от истинной концентраии СФ

109,1

97,3

97,3

45,5

268,0

101,6

101,6

101,6

98,7

98,7

98,7

98,7

98,3

68,9