Штамм бактерий lастовасillus рlаnтаruм - продуцент рестриктазы lp @
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в молекулярно-генетических исследованиях, микробиологической промышленности, в практике научно-исследовательской работы , Целью изобретения является выявление штамма Lactobacillus plantarum, обладающего более высоким выходом фермента. Штамм - продуцент Lactobacillus plantarum BKM В-578 выращивают в анаэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса штамма Lactobacillus plantarum 578 содержит новую эндонуклеазу рестрикции Lp0l, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК 5 А С G А Т в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах . Содержание рестриктазы в биомассе 6-7x10 ед./г сырой биомассы. Для изошизомера LpBI - рестриктазы Clal выход очищенного фермента около 430 ед./г сырой биомассы. Выход очищенного фермента Lp6 I 1,6-1,7х105 ед./г сырой биомассы, что примерно в 400 раз превышает известные цифры для рестриктазы Clal (430 ед.) сл с
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛ ИСТИЧ Е СКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ IlO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССР ;t4 Ф 1 ! ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4753077/13 (22) 12.07.89 (46) 23.09.91. Бюл. N 35 (71) Институт биологической и медицинской химии АМН СССР и Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (72) Н.Н.Соколов, И.И.Федор, А,Б.Фицнер, Н, В.Аникейчева, А.А. Калугин, Э. Б,Хорошутина, О.Т.Самка, Н.А,Коваленко и М.А,Эльдаров (53) 577.15 (088.8) (56) Mayer Н., Gross — chedl R„Schiltte Н., Н obom G. С! al. a new restriction . endonuclease from caryophanon latum L.— Nucl Acids Res 1981, ч.9, р.4833-4845, (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ LACTOBACILLUS PLANTARUM — ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ LPL (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в молекулярно-генетических исследованиях, микробиологической промышленности, в практике научно-исследовательской рабоИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в молекулярно-генетических исследованиях, микробиологической промышленности, в практике научно-исследовательской работы. Цель изобретения — выявление штамма Lactobacillus р1antarum — продуцента рестриктазы, обладающей более высоким выходом фермента, Штамм — и родуцент Lactobacillus plantarum ВКМ В вЂ” 578 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азата и минеральные соли в аназ- . Ы, 1678832 А1 ты, Целью изобретения является выявление штамма Lactobacillus plantarum, обладающего более высоким выходом фермента. Штамм — продуцент Lactobacillus plantarum BKM  — 578 выращивают в анаэрабных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса штамма Lactobacillus plantarum 578 содержит новую эндонуклеазу рестрикции Lpkl, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК 5 А Т С G А Т в количествах, достаточных для получения рестриктаэы в препаративных масштабах. Содержание рестриктазы в биомассе . 6 — 7х10 ед,/г сырой биомассы. Для изоши5 замера LpE — рестриктаэы Clal выход очищенного фермента около 430 ед,/г сырой биомассы. Выход очищенного фермента Lpf I1,,6 — 1,7х10 ед,/г сырой биомассы, что при5 мерно в 400 раз превышает известные цифры для рестриктаэы Clal (430 ед.). робных условиях, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Рестриктаза Lpki, изошизомер эндонуклеаэы рестрикции Clal узнает участок А Т С G А Т и расщепляет ДНК фага А в 15 участках, аденовируса 2 в двух, pBR322 в одном и не гидролизует ДНК вируса SV 40 и фХ174. Рестриктаэа рь представляет собой ценный инструмент для молекулярно-генетических исследований. Фермент имеет один участок расщепления на плазмиде pBR322 в гене, ответственном эа устойчивость к тетрациклину, Это обстоятельство 1678832 позволяет использовать вектор pBR322 для клонирования любого фермента ДНК с 5 -pCG — выступающими концами. Такие фрагменты ДНК образуются рестриктазой рг,1, а также Тас! I, Нра 11, Асу I, HgiD I, SciN I, Nar 1, Asu !! и другими, Поиск штамма — продуцента проводили при помощи разработанного экспресс-метода определения активности рестриктаз в толуольных экстрактах бактериальных клеток с последующим электрофорезом продуктов расщепления ДНК в агарозном геле, Штамм бактерий Lactobacitlus, piantarum 578 получен из Всесоюзной Коллекции Микроорганизмов АН СССР, где хранится под N ВКМ В вЂ” 57УССМ 1845, 1904 - ATCC 8014 = К CI В 8030, 6376 = NCTC 6376. Характеристика штамма, Морфологические свойства, Палочки, часто образуют цепочки, неподвижны, грэмположительны, Культурально-биохимические свойства, На скошенном агаре рост по штриху нежный. Колонии на агаре мелкие, блестящие, края ровные, На мясо-пептонном бульоне и бульоне Хоттингера — осадок, бульон прозрачный. Отношение к кислороду — анаэроб. утилизация углеводов — на глюкозе, лактозе, мальтозе, манните, сахарозе образует кислоту. Индол и сероводород — не образует. )Келатина уколом — разжижения нет, 4увствитель ность к антибиотикам, Культура чувс -вительна ко многим антибиотикам: пенициллину, стрептомицину, канамицину, тетрациклину, хлорамфениколу, эритромицину, олеандомицину, неомицину, карбенициллину, линкомицину, гентамицину, метициклину, оксациллину, нистатину, ампициллину; резистентна к полимиксину. Оптимальные условия выращивания и хранения. Культура хорошо растет íà МПБ, бульоне Хоттингера, среде В и среде N 7, без аэрации, при 30-37 C. Наибольший выход биомассы, содержащей рестриктазу Lp81, получают при выращивании на питательной среде, которая содержит в 1 л, г; дрожжевой экстракт 5; пептон 10; глюкоза 5; Иа НРО 12 Н О 2,2; NaCI з; MgS0n 0,5; CaCIz 0,25. Существенным фактором культивирования являются анаэробные условия. В аэробных условиях снижается выход фермента. Выделение рестриктазы проводят фракционированием и хроматографией на, колонках известными споcoáàìè. Пример 1. Культуру Lactobaciiius plantarum штамм 578 предварительно адаптируют на основной питательной среде, со10 держащей в 1 л ; дрожжевой экстракт 5; пептон 10; глюкоза 5; NagHP04 12Н20 2,2; КаС1 з; MgSOq 0,5, CaClz 0,25; при 37 С в течение ночи. Инокулят для ферментации готовят, пересевая адаптированную культуру на 1 л свежей среды из расчета 1:10, и размножают в отсутствие аэрации, Фермектацию культуры проводят после добавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему среды при 37 С при отсутствии аэрации; рН среды 7,2+0,2. Во время ферментации рН культуральной жидкости поддерживают в пределах 7,4 — 7,6, Выращивание продолжают до конца лаг-фазы, 15 Выход биомассы составляет 7 г/л культуральной жидкости. Содержание рестриктазы Lpl I б х 10 ед./г биомассы. Определение активности фермента проводят с помощью экспресс-метода в то20 луольных лизатах бактериальных клеток с последующим электрофорезом продуктов расщепления ДНК в агароэном геле. Выделение рестриктазы р 1, 3 r биомассы Lactobacillus plantarum 578 суспенди25 руют в буферном растворе и клетки разрушают ультразвуком при 2-4 С. После удаления остатков клеточных оболочек и неразрушенных клеток фермент фракционируют 1%-ным полиэтиленимином и затем 30 подвергают фракционированию в двухстадийной системе полиэтиленгликоль/декстрак, Обогащен кый рестриктазой экстракт диализуют и хроматографируют в калий-фосфатном буфере на колонке с 35 ДЭАЭ-целлюлозой (ОЕ-52,."Ватман" ), затем на колонке с голубой сефарозой, Получают 1,7 х 10 ед, фермента на г биомассы в 27,5 мл глицеринового буфера. Препарат рестриктазы Ьр1 1 стабильно со40 храняет активность в течение 9-12 мес. Фермент пригоден для анализа структуры ДНК и молекулярного клокирования, Пример 2. Культивирование штамма Lactobacli1us plantarum 578 проводят анало45 гично примеру 1 за исключением того, что в качестве питательной среды используют среду, которая содержит в 1 л; бульон Хоттингера 250 мл; глюкоза 20 r, Выход биомассы 8 r/ë культуральной жидкости. 50 Содержание рестриктазы в биомассе 7 х 10 ед,/r сырой биомассы. После проведения очистки, выход рестриктазы Lpti составил 1.6 х 10 ед./r биомассы. 55 Таким образом, по предлагаемому способу получают новую эндонуклеазу рестрикации Lpfl, Биомасса штамма 1 аctobacillus plantarum 578 содержит новую рестриктаэу ! рь l, узнающую и расщепляющую нуклео1678832 Составитель И,Привалова Техред М.Моргентал Корректор О.Ципле Редактор Н.Яцола Заказ 3183 Тираж 363 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 тидную последовательность ДН К вЂ” А Т С G А Т, в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах, Содержание рестриктазы в биомассе 6-7 х 10 ед,/г сырой биомассы. Для изошизомера 1 р11 — рестриктазы Clal, выход очищенного фермента на 1 r биомассы около 430 ед. Выход очищенной рестриктазы рР составляет 1,6-1,7 х 10 ед, активности на 1 5 г сырой биомассы, что примерно в 400 раз превышает значения, указанные для известной рестриктаэы С!а1(430 ед.). 5 Формула изобретения Штамм бактерий Lactobaclllus plantarum ВКМ В-578 — продуцент рестриктазы Lpfl.
