Способ определения адреналина в биологическом материале

 

Изобретение относится к физико-химическим методам анализа, в частности к потенциометрическому определению микроколичеств адреналина в биологических средах. Цель изобретения - повышение чувствительности и ускорение способа. Способ заключается в том, что в исходную пробу добавляют серотонин в конечной концентрации б КГ -б-КГ5 М, дезаминируют при помощи биоспецифического катализатора с моноаминоксидазной активностью и измеряют скорость дезаминирования серотонина в присутствии добавок адреналина. По скорости дезаминирования расчетным путем определяют концентрацию адреналина в исходной пробе. Изобретение позволяет в течение 40-60 мин провести определение адреналина в биопробе, минимальное определяемое количество адреналина моль/л. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/84

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОП И САН И Е И ЗОБ РЕТЕ Н ИЯ1 - а (сх +2а ) — 1 — 2а (х +2а )

1х 1х (" —.1)-(" -1) К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4460126/14 (22) 14.07.88 (46) 30,09.91. Бюл, М 36 (71) Латвийский государственный университет им. П,Стучки (72) Б.А,Гринберг, Е.B.Íèêîëüñêàÿ, А.В.Святковский, Д.Ю.Балцере, О.В.Ягодина и А.А,Прикулис (53) 612.015 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N. 1562858, 30.01.89. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДРЕНАЛИНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ (57) Изобретение относится к физико-химическим методам анализа, в частности к потенциометрическому определению

Изобретение относится к области физико-химических методов анализа, в частности к потенциометрическому определению микроколичеств адреналина в биологических средах и в других растворах, и может быть использовано в медицине и фармакологии.

Цель изобретения — повышение чувствительности и ускорение способа.

Способ осуществляется следующим образом.

К биоспецифическому катализатору с моноаминоксидазной (МАО) активностью добавляет сыворотку крови, боратный буфер, рН 7,6, и раствор сеоотонина в конечной концентрации 5 10 — 5-10 М, через измерительный сосуд в условиях термостатирования пропускают кислород, затем потенциометрически определяют выделение

Я2,, 1681268 А1 микроколичеств адреналина в биологических средах. Цель изобретения — повышение чувствительности и ускорение способа.

Способ заключается в том, что в исходную пробу добавляют серотонин в конечной концентрации 5 10 — 5 10 М, деэаминируют при помощи биоспецифического катализатора с моноаминоксидазной активностью и измеряют скорость дезаминирования серотонина в присутствии добавок адреналина.

По скорости дезаминирования расчетным путем определяют концентрацию адреналина в исходной пробе. Изобретение позволяет в течение 40 — 60 мин провести определение адреналина в биопробе, минимальное определяемое количество адреналина 2 ° 10 моль/л. 1 табл, аминопроизводных, фиксируя время падения потенциала на 0,3 ед. рН, Расчет количества адреналина проводят по формуле где !(х1 — количество адреналина в биологическом материале, моль/л, тх — время падения потенциала на 0.3 ед. рН в пробе без добавки адреналина, с; а — фиксированное количество адреналина;

Тх+а — ВрЕМя ПадЕНИя ПОтЕНцИаЛа На 0,3 ед. рН в пробе с добавкой а моль/л ядреналина, с;

1681268

tx+2a — время падения потенциала на 0,3 ед. рН в пробе с добавкой 2а моль/л адреналина, с.

Пример 1, Определение сыворотки в кро.ви.

Проба 1-я, 0,5 г биоспецифического катализатора с моноаминоксидаэной (MAO) активностью помещают между мембранами ячейки и промывают 0,01 М боратным буфе-ром (рН 7,6) и бидистиллированной водой.

Ячейку помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют туда же анализируемую пробу — 1 мл сыворотки крови и 2 мл 0,1 М боратного буфера (рН 9,0), Измерительный сосуд закрывают, помещают в термостат при 45ОС, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают 02 беэ СО . Далее поток 02 перекрывают, уобавляют в реакционную среду 1 мл 1 10 М раствора серотонина (концентрация в пробе 2;5.10 М). Сосуд герметически закрывают, включают мешалку и измеряют время падения потенциала на 0,3 ед. рН (tx = 380 с).

Продолжительность анализа 20 мин.

Проба 2-я, Анализируемую пробу подготавливают следующим образом, 0,5 г биоспецифического катализатора с

МАО активностью, подготовленную аналогично пробе 1-й, помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют туда же анализируемую пробу—

1 мл сыворотки крови, 1,8 мл 0,1 M боратного буфера (рН 9,0) и 0,2 мл 1 10 М раствора адреналина (стандартная добавка а = 5 10 М).

Далее выполняют все операции аналогично пробе 1-й.

Время падения потенциала на 0,3 ед. рН 496 с (tx+a = 496 с).

Продолжительность анализа 22 мин.

Проба 3-я. Выполняется аналогично пробе 2, но стандартная добавка адреналина — 0 2 мл 2 10 M раствора адреналина (1 ° 10 М в пробе). Время падения потенциала на 0,3 ед. рН равно 571 с (tx+2a = 571 с), Продолжительность анализа 26 мин.

Из данных, получаемых при анализе проб 1-, 2- и З-й, определяют концентрацию адреналина:

tx = 380 (найдено в пробе 1)

1х+е - 496 (найдено в пробе 2)

tx+m - 571 (найдено в пробе 3) а - 5 10 М (добавлено адреналина в пробе 21

2а = 1 ° 10 M (добавлено адреналина в пробе 3)

Согласно формулам

tx+a

tx+2a

5 1х находят

496

571

380 -1 =05

Согласно формуле l(x) = аЬ вЂ” 2abt

5 10 05 — 1 10 03

0,3 — 0,5 находят концентрацию адреналина в сыворотке крови:

12 = 2,5-10 М.

Пример 2. Определение адреналина

25 в экстракте сердца морской свинки.

Проба 1-я. 0,06 r препарата с МАО активностью (2), помещают между мембранами ячейки и промывают 0,01 М фосфатным буфером (pH 7,6) и бидистиллированной водой. Ячейку помещают в сосуд для измерения электрода с газовым зазором, добавляют туда же анализируемую пробу—

1 мл экстракта сердца морской свинки. Добавляют 2 мл 0,1 М боратного буфера (рН

9,0). Измерительный сосуд закрывают, помещают в термастат при 45 С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают Ог беэ СО . Далее поток перекрывают, добавляют в реакционную среду 1 мл 2 10 М раствора серотонина (концентрация в пробе 5.10 М). Сосуд герметически закрывают, включают мешалку и измеряют время падения потенциала на 0,3 ед. рН (tx = 760 с).

Продолжительность анализа 29 мин.

Проба 2-я. Анализируемую пробу подготавливают следующим образом.

0,06 r препарата с МА0 активностью помещают в сосуд для измерения электрода с газовым зазором, добавляют анализируемую пробу- 1 мл экстракта сердца морской свинки, 1,8 мл 0,1 M боратного буфера (рН

9,0) и 0,2 мл 4.10 М раствора адреналина (стандартная добавка а = 2 ° 10 ). Далее выполняют все операции аналогично пробе

1-й.

Время падения потенциала на 0,3 ед.

pH tx+a = 1400 с.

Продолжительность анализа 37 мин.

1681268

2а = I ° 10 М; а =5.10 М;

10 5..10 0,5 — 1 10 5 0,3

0,3 — 0,5

Ь1 = — — 1 = 0,84;Ьг—

1400, 1932

760 760

1 =1,54;

=25 10 М

В таблице представлены данные определения содержания адреналина в различных биологических материалах предложенным и известным способами.

Продолжительность определения предложенным способом 40-60 мин.

Продолжительность определения по способу-прототипу 2,5 — 3 ч (продолжительность инкубэции, полное дезаминирование, 25 установление постоянного потенциала).

Приведенные примеры показывают хорошее совпадение результатов, полученных предложенным и известным способам. В случае концентраций ниже 5 10 М известным способом адреналин не определяется, поскольку чувствительность метода недостаточна.

Чувствительность предложенного способа повышается на три порядка, минимальная определяемая концентрация 2 10

-9 моль/л.

= 1} 1О мол л

Формула изобретенияСпособ определения адреналина в био40 логическом материале путем дезаминирования моноамина при помощи биоспецифического катализатора с моноаминоксидазной активностью и последующей потенциометрической регистрации

45 аминопроизводных, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и ускорения способа, в исследуемые пробы дополнительно вводят серотонин и . концентрации 5 10 -5 ° 10 М, регистриру50 ют выделение аммиака в пробах. содержащих биологический материал, и фиксированное количество адреналина, а расчет проводят по формуле

55 tx +2m в (х) ь г

tx (к +га

1 )(х 2а

Проба 3-я. Выполняется аналогично пробе 2, но стандартная добавка адреналина — 0,2 мл 8.10 раствора адреналина; 2а

-5

= =4 10 М; 1х+га = 1932 с.

Продолжительность анализа 45 мин.

Из данных, полученных при анализе проб 1-, 2- и З-й, определяют содержание адреналина: а =2 10 М; 2а =4 . 10 М;! 2 10 1,54 — 4 10 0,84

0,84 — 1,54

Пример 3. Определение адреналйна в крови.

Проба 1-я. 0,5 r препарата с МАО активностью (1) подготавливают аналогично пробе 1-й примера 1. В сосуд для измерений электрода с газовым зазором добавляют анализируемую пробу — 1 мл крови, туда же добавляют 2 мл 0,1 М боратного буфера (рН

9,0); Измерительный сосуд закрывают, помещают в термостат при 45 С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают 02 без СОг. Далее поток 02 перекрывают, добавляют в реакционную сферу 1 мл 2 10 М серотонина (концентрация в пробе 5 10

M). Сосуд герметически закрывают, включают мешалку и измеряют время падения потенциала на 0 3 ед. рН tx= 360 с.

Продолжительность анализа 18 мин.

Проба 2-я. Выполняется аналогично пробе 1-й. В сосуд для измерения добавляют 1 мл крови. 18 мл 0,1 M боратного буфера (рН 9,0) и 0,2 мл 1 10 M раствора адреналина (концентрация стандартной добавки) а

- 5 10 М). Далее все выполняют аналогично пробе 1-й.

Время падения потенциала на 0,3 ед. рН равно =470 с.

Продолжительность анализа 23 мин.

Проба 3-я. В ы пол няется аналогично пробе 2, но стандартная добавка адреналина — 0,2 мл 2 ° 10 M-раствора адреналина;

2а = 1 ° 10 М; tx+2a = 543 с.

-5

Продолжительность анализа 25 мин, Из данных, полученных при анализе проб 1-, 2- и 3-й, определяют содержание адреналина:

tx+a = 470 С; tx+2a = 543 С;

470 543

5 360 360

b) = — — 1 =0,3; Ьг = — 1 =0,5;

1 Я12Щ

Известный способ

Содержание адреналина, моль/л

Предлагаемый способ

Биологический материал

Содержание адреналина, моль/л

Содержани адреналин моль/л

Продолжительность, мин одолжиь ность, ч

Раствор адреналина

Кровь

2,5 10

2,5 ° 10

2,5 ° 10

2,55 10

2,5

4 10

2,5-10

4,0 10

2,50 ° 10

2,0

2,5

Экстракт мышцы

Сыво отка к ови

С o c: t Fl l!l l e fl b k ) . 1 I! i. и л

Редактор Л. Веселовская Гехред M.1Ëîðlе-ll;ln I.ÿððãêTîð С. Шевкун

Заказ 3310 Тираж 390 ПОднисное

ВНИИПИ Госуд,;рсlo(,íllîãñ»l.ñìþåãë lo изМрегения;4 и 1гкрытичм нри ГКНТ СССР

11" .)35 Е1оскла, К-35 Р; > лг кая наб, 1/".Произвслкir.- > н::и: с. "» ..кии ко 1бl .-"1 > >1 - нl, . " ;+г iрод vл I ll г.рина, 101 где 1(к) — количество адреналина в биологическом материале, моль/л;

tx — время падения потенциала на 0.3 ед. рН в пробе без добавки адреналина, с; а — фиксированное количество адренапина;

2,48 ° 10

Не апредел (концентра недостаточ

То же

tl > " время падения потенциала на 0,3 ед. рН в пробе с добавкой а моль/л адреналина, с;

i<+y> — время падения потенциала на 0,3

5 ед. рН в пробе с добавкой 2а моль/л адреналина, с,