Штамм бактерий рsеudомоnаs sp., осуществляющий полное разложение метилацетата

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4761823/13 (22) 28.08,89 (46) 23.10.91. Бюл. В 39 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР и Институт микробиологии и вирусологии АН КазССР (72) Д.Ю.Раков, Н.B.Äîðîíèíà, Ю.А.Троценко и P M.Алиева (53) 663.15 (088.8) (56) Бюлер H., Пирсон Д. Органические синтезы, ч. 2, — M.: Мир, 1973.

Вейганд-Хильгетан. Методы эксперимента в органической химии. М.: Химия, 1968. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS

SP, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЙ ПОЛНОЕ РАЗЛОЖЕНИЕ МЕТИЛАЦЕТАТА

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности биологической очистке сточных вод, и касается нового штамма бактерий, который может быть использован при биологической очистке сточных вод ацетальдегидного производства.

Цель изобретения — получение нового штамма бактерий, обладающего способностью утилизировать метилацетат.

Метилацетат (метиловый эфир уксусной кислоты) — летучий, высокотоксичный синтетический поллютант, химически устойчивый при нормальных условиях.

Металацетат может быть гидролизован до ацетата и метанола химическим путем при нагревании в щелочных условиях. Та. Ы 1685995 А1 (з1)5 С 12 N 1/20, С 02 F 3/34 (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, который может быть использован при биологической очистке сточных вод ацетальдегидного производства. Штамм

Pseudomonas sp, BKM В-1736Д выделен из сточных вод ацетальдегидного производства в Казахской ССР. Штамм способен полностью разлагать метилацетат при его концентрации 0,1-6 г/л, за 5 — 8 ч, после предварительной адаптации не менее 3 пассажей на среде с метилацетатом, используя продукты его гидролиза — метанол и ацетат в качестве источников углерода и энергии.

1 табл. ким образом, при омылении метилацетата необходимы большие количества щелочи, что усугубляется низкой кислотностью стока ацетальдегидного производства (рН 3 — 4), и постоянное нагревание реактора (для отгонки метанола и смещения реакции в сторону разложения металацетата). В эк "гическом плане подобная очистка малоэффективна, поскольку образуется токсичный метанол, Создание дополнительных реакторов требует значительных капиталовложений.

Микробиологическая очистка имеет по сравнению с известным методом ряд пре- имуществ: полная утилизация метилацетата бактериями — деструкторами в локальном стоке и меньшие энергозатраты.

1685995

10

1,0

1,0

5,0

0,2

0,004

Выделен штамм Pseudomonos sp.

27RD, полностью разлагающий метилацетат. Штамм выделен из сточных вод ацетальдегидного производства. Штамм полностью разлагает метилацетат, используя его в качестве источника углерода и энергии.

Штамм имеет следующие культуральноморфологические и физиолого-биохимические свойства. .Культурально-морфологические признаки.

Клетки — бесцветнblå подвижные палочки 0,5 — 0,8 х 1,5-2,5 мкм с одним полярным жгутиком, грамотрицательные, неспорообразующие, не имеющие сложных внутрицитоплазматических мембран, подобных метанотрофным бакгериям. Не образует простек, Размножается путем деления пополам. Колонии на МГ1А до 4 мм в диаметре, округлые, с ровным краем, непрозрачные, белые, слизистые, поверхность гладкая, профиль выпуклый, структура однородная, консистенция маслянистая, Среды для выращивания: мясо-пептонный бульон (агар), синтетическая среда Д (пример I) с метилацетатом, глюкоза-картофельный агар.

Физиолого-биохимические признаки, Аэроб, расчет при температуре от l0 до

41 С, оптимум 28-32 С. Оптимум рН 6,8—

7,2, при рН 3,6 не растет, Флуоресцирующие пигменты, пиоцианин, каротиноиды не образует. Имеет аргининдигидролазу, каталазу, образует индол., Оксидазная реакция отрицательная. Нитраты восстанавливает в нитриты, Леван иэ сахарозы, ацетоин не образует. Желатин, целлюлозу. поли-Р -оксибутират, твин-80 не разлагает, но гидролизует крахмал. Г1оли- Р-оксибутират внутриклеточно не накапливает, DL-P-оксибутират не использует в качестве источника углерода в недостаточной по азоту среде. В качестве источника углерода для роста использует: метанол, этанол, мезо-инозит, метилацетат, этилацетат„бутилацетат, глюкозу, трегалозу, I -арабинозу, фруктозу, (=рамнозу, D-рибозу, D-ксилозу, сахарозу, ацетат, фумарат, сукцинат, а-кетоглутарат, 01 -валин, D-серин, Dl.-аргинин.

Среду с глюкозой подкисляет, газообразование отсутствует. Рост не обеспечивает формальдегид, формиат, метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, бетаин, саркозин, этилформиат, изопропанол, изобутанол, Р -аланин, 1 -серин, фенилаланин, глиоксилат, л-оксибензоат, m-оксибензоат, Анаэробно не ферменти25

55 рует гл юкозу, Не растет автотрофно в атмосфере СО + Нг + Og.

В качестве источника азота использует соли аммония, нитраты и некоторые аминокислоты. В ростовых факторах не нуждается. T.ïë, — 61,8.

Штамм обладает карбоксилэстеразой, катализирующей гидролиз эфирной связи метилацетата с образованием метанола и ацетата. Ацетат ассимилирует через цикл трикарбоновых кислот и глиоксилатный шунт (изоцитратлиазу ималатсинтазу).

Метанол использует через фруктоэобисфосфатальдолазный вариант рибулоэомонофосфатного цикла фиксации формальдегида. Карбоксилэстераза, дегидрогенаэы метанола (ФМС), формиата (ФМС), формальдегида (НАД) и гексулозофосфатсинтаза индуцибельны. Оксипируватредуктаза и рибулоэобисфосфаткарбоксилаза отсутствует.

Штамм является факультативным метилотрофом.

Условия хранения штамма.

Штамм хранится в лиофильно высушенном состоянии, защитная среда — молоко, При этом свойства штамма устойчивы, В лабораторных условиях культура поддерживается на косяках с МПА и пересевается через 2 нед, Поскольку ферменты, ответственные за деградацию метилацетата, индуцибельные, существенные отличия наблюдаются при использовании этого субстрата адаптированной и неадаптированнай культурой.

Адаптированная культура Pseudomonas sp.

ВКМ В-1736Д осуществляет полное разложение метилацетата при его концентрациях от 0,1 до 6 г/л за 5-48 ч соответственно (таблица 1), В стоках ацетальдегидного производства содержится около 0,15 — 0,20 г/л метилацетата, однако при залповых выбросах концентрация этого соединения может достигать 1,0-2,0 г/л.

Пример 1. Использование метилацетата неадаптированной культурой.

Культуру Pseudomonas sp. 27í0 (ВКМ

В-1736Д) выращивают на МПА в течение суток. Суспензию выросшей культуры (неадаптированной) высевают в колбы на 750 мл со 100 мл среды следующего состава, г/л дистиллированной воды; (N н4) Н2Р 04

К Н РОд

NaCI

MgSO4 7Н20

FeS04 7Н20

1685995

Составитель И.Болотина

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Т.Малец

Редактор Н.Яцола

Заказ 3576 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушсквя наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Среду стерилизуют при 1 атм 30 мин, метилацетат вносят в колбу в концентрации

2 г/л и после засева закрывают резиновой пробкой для предотвращения испарения метил ацетата.

Культуру выращивают на качалке при

180 об/мин при 29 С. Контроль за процессом деградации метилацетата осуществляют хроматографически. Колонка (70 см;

9 -2 мм) заполнена Порапаком Q, скорость

Нг 30 мл/мин, воздуха 300 мл/мин, и -30мл !мин, Температура колонки 110 С. Ацетат определяют на газовом хроматографе. Колонка (1,8 м; ,О - 4 мм), заполнена Порапаком QS. Скорость Нг 35 мл/мин, воздуха 300 мл/мин, Nz

35 мл/мин, Температура колонки 160 С.

Процесс разложения метилацетата неадаптированной культурой начинается только через 4 сут, Содержание метилацотата по данным газовой хроматографии через 43 сут составляет 93 от исходного, через 5 сут

75, через 6 сут 25, через 7 сут метилацетат и продукты его гидролиза — метанол и ацетат в среде не обнаруживается. Период активной деградации метилацетата совпадает с активным приростом биомассы.

Il р и м е р 2. Использование метилацетата адаптированной культурой.

30 мл суспензии, выросшей на среде с метилацетатом двухсуточной культуры

Pseudomonas sp. 27RD (адаптированной, не менее 3 пассажей на среде с метилацетатом), высевают в колбы на 750 мл со 100 мл среды, описанной в примере 1.

В качестве источника углерода в энергии вносят 2 г/л метилацетата, Количествен5 ный газохроматографический анализ культуральной жидкости на содержание метилацетата, метанола и ацетата проводят через каждый 3 ч в течение 24 ч культивирования. К 6 ч культивирования в среде накап10 ливается около 0,015 г/л метанола, который полностью исчезнет к 21 ч. Ацетат отсутствует в течение всего периода культивирования. К 12 ч содержание метилацетата в среде составляет 15 от исходного. Анализ

15 культуральной жидкости через 24 ч свидетельствует о полном использовании метилацетата.

Таким образом, штамм Pseudomonas

s p. 27RD (В КМ В-1736Д) обладает способно20 стью полностью разлагать метилацетат при его концентрации до 6 г/л, используя продукты его гидролиэа ацетат и метанол в качестве источников углерода и энергии, что обеспечивает возможность использования

25 данного штамма при очистке промышленных сточных вод ацетальдегидного производства.

Формула изобретения

30 Штамм бактерий Pseudomonas sp, ВКМ

В-1736Д, осуществляющий полное разложение метилацетата,