Штамм бактерий bacillus alvei - продуцент рестриктазы в @ 1
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в практике научно-исследовательской работы в молекулярной биологии и генетической инженерии . Целью изобретения является выявление штамма Bacillus alvei, обладающего более высоким выходом рестриказы Bav I. Штамм - продуцент Bacillus alvei ВКМ В- 675 выращивают на питательной среде, содержащей бульон Хоттингера, в условиях аэрации, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса штамма Bacillus alvei 675 содержит рестриктазу Bav I, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК CAG CTG в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах. Для изошизомера Bav I - рестриктазы Pvu II выход очищенного фермента 370 ед.на 1 г сырого веса биомассы. Выход очищенного фермента Bav I составляет 2,0-2,4x10 ед. активности на 1 г сырой биомассы, что в 5-6 раз превышает известного Pvu II (370 ед). СО с
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (51>s С 12 N 9/14, 1/20
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ, ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4754852/13 (22) 12.07.90 (46) 23,09.91. Бюл. ¹ 35 (71) Институт биологической и медицинской химии AMH СССР и Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (72) Н.Н.Соколов, И.И,Фодор, Н,В.Аникейчева, А.Б.Фицнер, А.А,Калугин, Э.Б,Хорошутина, О.Т.Самко и M.А,Эльдаров (53) 577.15 (088.8) (56) Gingeras Т.R., Greenougl L., Яс1И1(Псгацс
1., Roberts R.J. Two new restriction
andonucleases from Proteus vulgarls. — Nucl.
Acids Res, 1981, ч.9, р.4525-4536. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS А1 1/Е!—
ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ BAV 1 (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в практике научно-исследовательской работы в молекулярной биологии и генетической инженеИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в практике научно-исследовательской работы, в молекулярной биологии и генетической инженерии.
Цель изобретения — выявление штамма
Bacillus alvel, обладающего более высоким выходом рестриктазы.
Штамм — продуцент Bacillus alvei 675 выращивают на питательной среде, содержащей бульон Хоттингера, в условиях аэрации, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами.
Рестриктаза Вач 1 — изошиэомер рестриктазы Pvu 11, узнает участок нуклеотидной последовательности ДНК CAG 4 CTG u расщепляет ДНК бактериофага А в 15участ„„ Ж„„1678833 А1 рии. Целью изобретения является выявление штамма Bacillus alvei, обладающего более высоким выходом рестриказы Вач I.
Штамм — продуцент Bacillus alvel ВКМ В675 выращивают на питательной среде, содержащей бульон Хоттингера, в условиях аэрации, целевой. продукт выделяют из полученной биомассы известными методами.
Биомасса штамма Bacillus alvei 675 содержит рестриктазу Вач I, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность
ДНК CAG СТО в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах. Для иэошиэомера Вач 1-. рестриктаэы Pvu il выход очищенного фермента 370 ед,на 1 г сырого веса биомассы.
Выход очищенного фермента Вач I составляет 2,0 — 2,4х10 ед. активности на 1 г сырой
3 биомассы, что в 5 — 6 раз превышает известного Pvu 11 (370 ед). ках, ДНК аденовируса 2 в 24, ДНК SV 40 в трех, плазмиду pBR322 в одном и не гидролиэует ДН К 5XI74.
Поиск штамма — продуцента проводили с помощью разработанного экспресс-метода тестирования активности рестриктаз в толуольных экстрактах иэ микробных клеток с последующим электрофорезом в агароэном геле продуктов расщепления ДНК.
Штамм Bacillus alvei 675 получен из
Всесоюзной Коллекции Микроорганизмов
АН СССР, где хранится под ¹ ВКМ 6754NCIB 8212 и не является идентичным штамму Bacillus alvei АТСС 6348, продуценту известной рестриктазы Bav I, Характеристика штамма.
Морфологические свойства. Палочки размером 05-0,8 х 2 — 3 мкм расположены
1678833 поодиночке и парами, споры, Грам-положительны (признак непостоянный, варьирует
Гр -Гр ), Клетки подвижны (признак ва рьирует), Культурально-биохимические свойства. 5
На скошенном агаре — слабый нежный налет. Колонии на МПА очень мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями, На мясо-пептонном бульоне и бульоне Хоттингера — равномерное помутнение, сероватая 10 нежная пленка, Отношение к кислороду— аэроб. Утилизация углеводов — на глюкозе, лактозе, сахарозе образует кислоту, Лакму. совое молоко — свертывание, пептонизация.
Индол — не образует. Желатина уколом — 15 медленное, кратерообразное разжижение.
Чувствительность к антибиотикам, Культура обладает множественной резистентностью к антибиотикам. Резистентна к пенициллину, стрептомицину, канамицину, 20 полимиксину, неомицину, метициклину, нистатину, ампициллину, Чувствительна к тетрациклину, левомицетину, эритромицину, олеаидомицину, карбенициллину, линкомицину, гентамицину, оксациллину. 25
Оптимальные условия выращивания и хранения (среда, рН, температура, срок пересева). Куль ура хорошо растет на твердых и жидких питательных полноценных средах; мясо-пептонном агаре, бульоне Хоттингера, 30 среде LB.
На бульоне Хоттингера за 4-5 ч рост достигает Аюо =- 1,2 — 1,4, Выход биомассы
6 — 8 г/л, При выращивании на среде LB накопление биомассы ниже 4 — 5 г/л. 35
Оптимальные для образования рестриктазы Bav 675! условия — культивирование на среде Хоттингера в течение 4 — 5 ч до достижения конца логарифмической фазы роста. 40
На среде "рыбный экстракт" культура растет медленно, а активность рестриктазы в биомассе значительно ниже, чем при культивировании на средах Хоттингера и LB.
Оптимальная температура роста 37 С, 45 но растет и при 40 — 45 С, Рабочие культуры пересевают на бульон Хоттингера один раз в 7 — 10 дн. Хранят культуру в полужидком агаре под вазелиновым маслом или в лиофилизированном со- 50 стоянии в ампулах.
Культура непатогенна для мышей.
Существенным фактором культивирования является аэрация, В анаэробных условиях выход рестриктазы Bav I снижается, 55
Инкубационная смесь для определения активности рестриктазы Вач 675! обьемом
25 — 50 мкм содержит 0,01 M трис-HCI, рН
7,5, 0,01 Mg CIz, 0,001 M дитиотреитола, 0,05
M МаС!, 1 мкг ДНК фага Я и 1 — 20 мкл фермента. Инкубируюг при 37 С в течение 60 мин, Продукты расщепления ДНК рестриктаэой определяют электрафорезом инкубационной смеси в геле агарозы с последующим прокрашиванием геля бромидом этидия, За единицу активности фермента принимают то минимальное количество (в мкл), которое необходимо для полного расщепления 1 мкг ДНК фага il npu
37 С за 1 ч инкубации в стандартных условиях инкубационной смеси.
Выделение рестриктазы проводят фракционированием и хроматографией на колонках. Полученный фермент проявляет активность в присутствии MgCI2 в концентрации 5-410 мМ при значении рН 7,5 — 8,3 и температуре 30 С. Добавление в инкубационную среду КС! (20-30 мМ) стимулирует активность фермента, в более высокой концентрации (100 мМ) KCI ингибирует рестриктазную активность, Пример 1. Культуру Bacillus alvei BKM
 — 675 предварительно адаптируют на основной питательной среде (бульон Хоттингера), содержащей в 1 л 250 мл основного перевара Хоттингера, 10 r NaCI, 1 г KgHP04 и до 1 л воды. Инокулят для ферментера готовят, пересевая адаптированную культуру на 1 л свежей среды из расчета 1;10 и размножают в условиях аэрации.
Выращивание культуры проводят после добавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему среды при 37 С в условиях аэрации (1 л воздуха на 1 л питательной среды), рН среды 7,6, Во время ферментации рН культуральной жидкости поддерживают в интервале 7,4-7,6, Выращивание продолжают до достижения конца логарифмической фазы роста. Выход сырой биомассы составляет 8 г/л культуральной жидкости. Содержание рестриктазы Вач I 6 х 10з ед,/г биомассы.
Определение активности фермента проводят во фракциях градиента после хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе (DE-52, "Ватман" ) экстрактов из обработанных ультразвуком клеток с последующим электрофорезом в агарозном геле продуктов расщепления ДН К.
Выделение эндонуклеазы рестрикции
Bav 675 I.
10 r биомассы Bacillus alvel 675 суспендируют в буферном растворе и клетки разрушают ультразвуком при 2 — 4 С. После удаления остатков клеточных оболочек и неразрушенных клеток фермент фракционируют в двухфазной системе полиэтиленгликоль / декстран. Обогащенную рестриктазой верхнюю фазу хроматографируют в калий-фосфатном буфере в градиенте KCI на
1678833
Составитель И.Привалова
Техред М.Моргентал Корректор Н.Король
Редактор Н.Яцола
Заказ 3183 Тираж 362 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (DE — 52, "Ватман"), затем на колонке с голубой сефарозой.
Получают 2,4х10 ед. активности рестриктазы в 4,0 мл глицеринового буфера, Выход очищенного препарата фермента
2,4х10 ед. активности на 1 г сырого веса биомассы. Препарат рестриктазы Вач 675 l стабильно сохраняет активность в течение не менее 6 — 9 мес. Фермент пригоден для картирования ДНК и генно-инженерных работ.
Пример 2. Культивирование штамма
Bacillus а!че! 675 проводят аналогично описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве питательной среды используют среду LB, которая содержит в 1 л 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г
NaCI и до 1 л воды.
Выход биомассы 5 г/л культуральной жидкости. Содержание рестриктаэы в биомассе 5х10 ед,/г биомассы. После проведения очистки фермента, выход рестриктаэы
Вач 675 составил 2,0x10 ед,/г биомассы.
Таким образом, биомассы штамма
Bacillus alvei 675 содержит рестриктаэу Bav
5 I, узнающую и расщепляющую нуклеотидную.последовательность ДНК CAG ФCTG, в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах.
Содержание рестриктазы Вач l в био10 массе 5 — 6х10 ед. на 1 г сырой биомассы, з
Для изошиэомера Ван — рестриктаэы Pvu !! содержание фермента ниже, Выход очищенного фермента Вач составляет 2,02,4х10 ед, активности на 1 г сырой
15 биомассы, выход очищенной рестриктазы
Pvu !! — 370 ед. на 1 г биомассы. Рестриктаза
Bav не содержит примесей неспецифических эндонуклеаэ и экзонуклеаэ, 20 Формула изобретения
Штамм бактерий Bacillus alvei ВКМ В675 — продуцент рестриктазы Вач !,
