Способ измерения уровня клозапина в сыворотке крови

 

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической фармакологии. Цель изобретения - повышение чувствительности - достигается при использовании рецепторного материала, выделенного из хвостатого ядра головного мозга быка, в концентрации 21 - 25 мкг/мл и проведении инкубации сыворотки с рецепторным материалом и радиоактивным лигандом одновременно. Способ позволяет определять клозапин в 4 раза чувствительнее по сравнению с прототипом.

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической фармакологии, и касается способа определения уровня клозапина (лепонекса) в биологических жидкостях радиорецепторным методом. Изобретение может быть использовано в лечебной практике для проведения лекарственного мониторинга путем определения в крови концентрации клозапина, в области клинико-фармакологических исследований для решения задач, связанных с оптимизацией психофармакотерапии. Цель изобретения - повышение чувствительности способа. Способ осуществляется следующим образом. Рецепторный материал, содержащий М-холинорецепторы: хвостатые ядра мозга быка, гомогенизируют в 40 объемах (вес/объем) холодного 50 мМ Трис-HCl буфера, рН 7,4, используя гомогенизатор типа "Ultra turraх" в течение 40 с. Гомогенат центрифугируют при 30000 g в течение 30 мин при 4^oC. Супернатант сливают, осадок ресуспендируют в 40 объемах буфера и повторяют процедуру гомогенизации и центрифугирования еще два раза в тех же условиях. Конечный осадок разводят до концентрации 100 мг исходной ткани/мл 50 мМ натрий-фосфатным буфером, содержащим 10 мкМ паргилина, рН 7,4. Суспензию разливают на аликвоты и хранят до использования при -70^oC. Характеристики рецепторного материала: K_д = 0,16±0,01 нМ, максимальное число мест связывания 752±40 фмоль/мг исходной ткани до ³Н - QNB. Стандарты: для измерения уровня клозапина используют сыворотку крови без клозапина и сыворотки, содержащие известные количества клозапина в диапазоне концентраций от 7,5 до 250 нг/мл сыворотки, которые готовят путем серийных разведений под контролем весов. Меченый лиганд: ³Н - QNB, фирма "NEN", Англия, 39 ки/ммоль. Все используемые реагенты, кроме сывороток, готовят на 50 мМ натрий-фосфатном буфере, содержащем 10 мкМ паргилина, рН 7,4. Для определения в стеклянной пробирке объемом 10 мл смешивают 100 мкл сыворотки, не содержащей клозапина или содержащей стандартные известные количества клозапина, 1,75 мл ³Н-QNB (конечная концентрация 0,15-0,30 нМ) и 200 мкл мембранного препарата рецептора (конечная концентрация 21-25 мкг белка/мл), который перед употреблением размораживают, разводят натрий-фосфатным буфером в 20 раз и гомогенизируют. Общий объем среды инкубации 2 мл. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют при комнатной температуре (21-25^oC) в течение 50-60 мин. Затем в каждую пробу добавляют 5 мл охлажденного до 4^oC натрий-фосфатного буфера и тотчас фильтруют через смоченные тем же буфером стекловолокнистые фильтры типа GF/B. Фильтры промывают дополнительно два раза по 5 мл тем же буфером и помещают во флаконы со сцинтилляционной жидкостью. Радиоактивность проб подсчитывают через 6-18 ч. Для определения неспецифического связывания в пробирки, содержащие сыворотку без клозапина, вносят по 10 мкмл атропина (конечная концентрация 10 мкМ) до добавления в них ³Н-QNB. Специфическое связывание вычисляют как разность счета радиоактивности в пробах, не содержащих и содержащих атропин. При обработке результатов вычисляют процент ингибирования специфического связывания ³Н-QNB в присутствии сыворотки, не содержащей клозапина, сыворотками, содержащими стандартные количества клозапина. Определение концентрации клозапина в анализируемых образцах сыворотки проводят графическим методом по калибровочной кривой (процент ингибирования - концентрация клозапина в сыворотке). Процент ингибирования специфического связывания вычисляют по формуле 100 (%) , где B_o и B₁ - величины специфического связывания ³Н - лиганда с рецепторами в отсутствие и в присутствии разных концентраций клозапина. Таким образом, способ позволяет определять минимальную концентрацию клозапина 12 мг/мл, что в четыре раза чувствительнее по сравнению с прототипом.

Формула изобретения

СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ УРОВНЯ КЛОЗАПИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ путем получения связывающего агента, смешения его с образцом сыворотки и радиоактивным лигандом с последующим радиорецепторным анализом, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве связывающего агента используют рецепторный материал, выделенный из хвостатого ядра головного мозга быка, в концентрации 21 - 25 мкг белка/мл, а инкубацию сыворотки с рецепторным материалом и радиоактивным лигандом проводят одновременно в течение 50 - 60 мин.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 32-2000

Извещение опубликовано: 20.11.2000        

---