Способ получения белкового гидролизата

 

Изобретение относится к производству биохимических препаратов и может найти применение в микробиологической промышленности , а также в фармацевтической промышленности для контроля стерильности лекарственных средств. Целью изобретения является повышение качества белкового гидролизата за счет обеспечения высокого содержания аминного азота. Способа заключается в том. что в качестве исходного сырья используют отходы - фарш свиных почек после выделения аминоацилазы, причем отработанный почечный фарш перед гидролизом подвергают термообработке при 85-95°С в течение 10-20 мин, гидролиз осуществляют при рН 7,4-8,0 и непрерывном перемешивании, а балластные белки от гидролизата отделяют при рН 4.7-5,5. 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю С 12 и 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4634159/13 (22) 09.01.89 (46) 23.11.91. Бюл. N. 43 (71) Научно-производственное объединение

"Биолар" АН СССР (72) Л. B Ефремова, С. Ф. Яблонская, И. А.

Аболиня, Т. Ф. Фридман, В. H. Родионов и

И. А. Стикуте . (53) 576.8.093.1(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N1261948,,кл. С 12 N 1/20, 1986. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВОГО

ГИДРОЛ ИЗАТА (57) Изобретение относится к производству биохимических препаратов .и может найти применение в микробиологической проИзобретение относится к производству биохимических препаратов и может найти применение в микробиологической промышленности, а также в фармацевтической промышленности для контроля стерильности лекарственных средств.

Целью изобретения является повышение качества белкового гидролизата за счет обеспечения высокого содержания аминного азота, Способ осуществляется следующим образом.

В качестве исходного сырья используют . отходы — фарш свиных почек после выделения аминоацилазы, причем отработанный почечный фарш перед гидролизом подвергают термообработке при 85-95 С в течение

10-20 мин, гидролиз осуществляют при рН

7,4-8.0 и непрерывном перемешивании, а балластные белки от гидролизата отделяют

„„5U „„1693042 А1 мышленности, а также в фармацевтической промышленности для контроля стерильности лекарственных средств. Целью изобретения является повышение качества белкового гидролизата эа счет обеспечения высокого содержания аминного азота. Способа заключается в том, что в качестве исходного сырья используют отходы — фарш свиных почек после выделения аминоацилазы, причем отработанный почечный фарш перед гидролизом подвергают термообработке при 85-95 С в течение 10-20 мин, гидролиз осуществляют при рН 7,4-8,0 и непрерывном перемешивании, а балластные белки от гидролизата отделяют при рН

4,7-5,5. 4 табл. при рН 4,7-5,5 и постоянное значение рН в процессе гидролизата поддерживают карбонатом или бикарбонатом натрия.

Термообработка почечного фарша при

85-95 С в течение 10-20 мин способствует денатурации белка, что приводит к повышению чувствительности к протеолитическим ферментам.

Однако при длительном нагреве или нагреве при более высоких температурах устойчивость белков к ферментам либо не меняется, либо повышается. Оптимальной является термообработка при 85-95 С в течение 10-20 мин. Предварительная термообработка обеспечиваеттакжедополнительную защиту от роста посторонней микрофлоры в процессе гидролиза.

Почки содержат около 10 полноценных белков, богаты витаминами и микроэлементами. По содержанию отдельных

1693042

15

30 витаминов и микроэлементов почки превосходят говядину. Применение в качестве исходного сырья почечного фарша позволяет получить гидролизат, содержащий ростовые вещества, неорганические соединения фосфора, калия, магния, железа, а также микроэлементы: медь, марганец, молибден, Ведение процесса гидролиза панкреатином при HenpepblBHQM перемешивании (массообмена при ферментативном гидролизе имеет большое значение) и рН 7,4-8,0

Интенсифицирует процесс и повышает качество гидролизата, так как увеличивает количество свободных аминокислот. Гидролиэат содержит 65-80 свободных аминокислот

16 наименований, среди них незаменимые аминокислоты: аргинин, валин, гистидин, изолейцин, лизин, лейцин, метионин, треонин, фенилаланин. Отделение негидролизованного белка при рН 4,7-5,8 предохраняет

От выпадания в осадок фосфорсодержащих соединений, некоторых катионов.

Данные изменения показателей качества гидролизата в зависимости от рН приведены в табл, 1, При более низком значении рН увеличивается зольность получаемого препарата, при повышении рН уменьшается доля свободных аминокислот. В интервале рН 4,75,5 при нагревании быстро происходит коагуляция негидролиэованного белка, а также уменьшаются затраты времени на фильтрование.

Пример 1. В стеклянный реактор с рубашкой (объем 20 л) заливают 12 л деминерализованной воды и нагревают до 85 С.

Включив мешалку, загружают в реактор 6 кг почечного фарша, отходы после выделения аминоацилазы.. Температуру смеси доводят до 85 С и выдерживают при данной температуре в течение 10 мин. Затем температуру в реакторе снижают до 38-42 С, устанавливают рН 8,0 добавлением карбоната или бикарбоната натрия и вводят панкреатин в виде суспенэии в количестве 120 r. Через 30 мин, а затем через 1 ч проверяют реакцию смеси и при необходимости подщелачивают до рН 7,4, Добавляют в реактор 150 мл хлороформа. Гидролиз ведут при рН 7,4 при постоянном перемешивании при 38-42 С в течение 24 ч. По окончании гидролиза смесь подкисляют добавлением кислоты до рН

4,7, температуру в реакторе поднимают до

90 С и, выключив мешалку, выдерживают смесь при указанной температуре в течение

0,5-1,0 ч, Получен н ый гидролиэат фил ьтруют через капроновый фильтр. В фильтрате определяют содержание аминного азота, равное 710 мг .

Пример 2. В стеклянный реактор с рубашкой (объем 20 л) заливают 12 л деминерализованной воды и нагревают до 88 С.

Включив мешалку, загружают 6 кг почечного фарша, отходы после выделения аминоацилазы. Температуру смеси поднимают до

88 С и выдерживают при данной температуре в течение 15 мин. Смесь охлаждают до

38-42 С, устанавливают рН 8,0 добавлением карбоната или бикарбоната натрия и вводят панкреатин в виде суспензии в количестве

120 г, Через 30 мин после добавления фермента проверяют реакцию смеси и подщелачивают до рН 8.0. Через 1 ч проводят повторную корректировку рН, В реактор вводят 150 мл хлороформа и ведут гидролиз при непрерывном перемешивании при рН

7,8 и 38-42 С в течение 24 ч. Содержимое реактора подкисляют до рН 5,2, температуру в реакторе доводят до 90 С и, выключив мешалку, выдерживают смесь при данной температуре в течение 0,5-1.0 ч. Полученный гидролизат фильтруют через капроновый фильтр. В фильтрате определяют содержаwe аминного азота, равное 690 мг .

Пример 3, В стеклянный реактор с рубашкой (объем 20 л) заливают 12 л деминерализованной воды и нагревают до 95 С.

Включив мешалку, загружают 6 кг почечного фарша. Температуру смеси поднимают до

95 С и выдерживают приданной температуре в течение 20 мин. Смесь охлаждают до

38-42 С, устанавливают рН 8,0добавлением карбоната или бикарбоната натрия и вводят панкреатин в виде суспензии в количестве

120 г. Через 30 мин после добавления фермента проверяют реакцию смеси и подщелачивают до рН 8,0. Через 1 ч проводят повторную корректировку рН. В реактор вводят 150 мл хлороформа и ведут гидролиэ при непрерывном перемешивании при рН

8,0 и 38-42 С в течение 24 ч. Затем содержимое реактора подкисляют кислотой до рН

5,5, температуру е реакторе доводят до 90 С и, выключив мешалку, выдерживают смесь при данной температуре в течение 0,5-1,0 ч.

Полученный гидролизат фильтруют через капроновый фильтр. В фильтрате определяют содержание аминного азота, равное 680 мг=,ь.

Пример 4. Отмеряют 1 л дистиллированной воды, 13 г агара Заливают 200 мл дистиллированной воды и оставляют на 30 мин для набухания, В колбу вносят 14 r панкреатического почечного гидролиэата

5,0 г хлорида натрия, 1,0 r глюкозы и растворяют в 800 мл дистиллированной воды при нагревании, прибавляют замоченный агар. раствор нагревают до полного его расплавления. Устанавливают рН 7,5 -0,2. При не1б93042

15

30

40

55 обходимости фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Разливают в пробирки по 4 мл и в колбы по 150 мл. Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром поддавлением при 121 С в течение 15 мин.

Испытание ростовых свойств среды проводят с помощью контрольного штамма

Bacillus cereus АТСС 10702 и другими азробными микроорганизмами. 1 мл суточной культуры Bacillus cereus АТСС 10702 (или другого азробного микроорганизма) вносят в 100 мл стерильного 0,9ь-ного изотонического раствора хлорида натрия. По стандарту мутности для оптической стандартизэции бактерийных взвесей определяют мутность полученной взвеси и соответствующую концентрацию бактерий тест-штамма. Затем готовят разведения, по

1 мл каждого раствора вносят в чашку Петри со средой и распределяют шпателем по поверхности. Инкубируют в термостате не менее 48 ч при 38 С, хотя для получения достоверных данных по ростовым свойствам среды достаточно и 24-часового инкубирования. Результаты оценки роста тест-штамм Bacillus cereus АТСС 10702 и других азробных микроорганизмов после 24 ч инкубирования представлены в табл, 2, Количественное определение общего числа бактерий с помощью предлагаемой среды и среды на мясопептонном агаре проводят двухслойным агаровым методом в чашках Петри диаметром 90-100 мм. Образец лекарственного средства в количестве

10 r растворяют или суспендируют в фосфатном буферном растворе рН 7,0 так, чтобы конечный объем раствора был 100 мл.

Приготовленный раствор образца вносят по

1 мл в каждую из двух пробирок с 4 мл расплавленной и охлажденной до 45-50 С среды, Быстро перемешивают содержимое пробирки и переносят в чашку Петри, содержащую 15-20 мл застывшей питательной среды, Быстрым покачиванием чашки Петри равномерно распределяют верхний слой 45 агэра. После застывания среды чашки переворачивают и инкубируют в течение 5 сут при

30-35 С. Через 48 ч и окончательно через 5 сут подсчитывают число бактериальных колоний на двух чашках, находят среднее значение и, умножая его на показатель разведения, вычисляют число бактерий в 1 г образца.

Пример 5. В 1 л дистиллированной воды последовательно растворяют 13 г панкреатического почечного гидролизата, 7,5 г натрия фосфата двузамещенного, 2,5 г калия фосфата однозамещенного, 10 r глюкозы, прибавляют 8 мл .1;(-ного раствора фенолового красного (008 г) и 3 мл 0,5 -ного раствора малахитового зеленого (0,015 r).

Устанавливают рН 7,5- 0,2 и кипятят 1 мин, фильтруют через бумажный фильтр, Стерилизуют насыщенным паром под давлением при 121 С в течение 15 мин в паровом стерилизаторе, Ростовые свойства предлагаемой среды определяют с помощью тест-штамма

Escherichia сой ATCC 25922, Salmonella

typhl,1 мл суточной культуры Escherlchia cali или Salmonella сурЫ вносят в 100 мл стерильного 0,97;-ного изотонического раствора хлорида натрия. По стандарту мутности для бактерийных взвесей определяют мутность полученной взвеси и соответствующую концентрацию бактерий тест-штамма, Затем готовят разведение, по 1 мл каждого раствора вносят в колбу со 100 мл питательной среды и инкубируют в термостате при температуре 30-35 С в течение 24-48 ч, Результаты приведены в табл. 3.

Предлагаемую питательную среду испытывают при контроле на микробиологическую чистоту нестерильных лекарственных средств для выявления бактерий семейства

Entегоbacteriaceal. Испытания проводят по следующей методике: образец лекарственного средства в количестве 10 г вносят в 100 мл питательной среды, перемешивают и инкубируют при 30-35 С в течение 24-48 ч.

Наличие роста определяют по помутнению среды, а также газообразованию. Для сравнения используют среду на мясопептонном бульоне по прототипу.

Данные по выявлению бактерий семейства Entегоbacteriaceae в лекарственных препаратах и вспомогательном сырье приведены в табл, 4.

Как видно, предлагаемая питательная среда позволяет проводить выявление бак-, терий семейства Entегоbacteriaceae на уровне среды на мясопептонном бульоне, Полученный гидролизат используется для приготовления питательных сред, которые применяются в микробиологической промышленности и в фармацевтической промышленности для контроля стерильности лекарственных средств, в частности при контроле микробной загрязненности нестерильных лекарственных средств и вспомогательного сырья на средах с разными источниками азотного питания.

Формула изобретения

Способ получения белкового гидроли-. зата включающий гидролиз исходного сырья панкреатином, инактивацию фермента. отделение балластных белков и осветление целевого продукта, о тл и ч а ю шийся

1693042 тем, что, с целью повышения качества белкового гидролизата за счет обеспечения высокого содержания аминного азота, в качестве исходного сырья используют почечный фарш после водной экстракции аминоацилазы, причем исходный материал перед гидролизом подвергают термообработке при 85-95 С в течение 10-20 мин, гидролиз осуществляют при рН 7,4-8,0 и непрерывном перемешивании, а балласт5 ные белки от гидролизата отделяют при рН

4,7-5,5.

Таблица 1

Таблица 2

Характеристика роста на питательной среде на основе панкреатического почечного гидролизата 14 г/л

Stap.

hylococcus

aureus

Pscudomoпаз aerugiпоза

Bacillus

subtilis

E scheric hla

coll

Bacillus

cereus

Salmohella

typhl

++++

++++

+++

+++

+++

++

+

Нет роста

++++

++++

+++

П р и м е ч а н и е.++++-сплошной, обильный рост тест-культуры:+++ — хороший рост, масса слившихся колоний; ++ — умеренный рост; + — отдельные колонии и накопление колоний, т,е. имеется рост микроорганизмов.

Количество клеток в 1 мл 0,9 -ного раствора

NaCl

8,5 10

8,5 10

8,5 10

8,5 10

8,5 10

8,5 10

8.5 10

8,5

++++

++++

+++

+++

+++

++

++++

++++

+++

+++

+++

++

+

++++

++++

+++

+++

+++ ++

Нет роста

++++

++++

+++

+++

+++

+

Нет роста

+++

++1

++

Нет роста

1б93042

Таблица 3

Питательная среда на основе почечного панкреатического гидолизата и и кон ент а иях гид олизата, г(л

10

15

+н

+++

+++

П р и м е ч а н и е. +++ — сильное помутнение и газообразование:++-умеренное помутнение и газообрэзование; + — помутнение (во всех случаях изменения цвета среды с красно-коричневого на оранжевый).

Таблица 4

Выявление бактерий семейства

EntегоbacterIaceor в 10 г с бст ата

Проба

Количество проб

Среда на мясной во е и пептоне

Среда на белковом гид олизате

Ортофен (таблетки) Ибупрафен (таблетки) Зтацизин (таблетки) Этмозин (таблетки) Пиперазин-адипинат (порошок) Мука пшеничная

Стеарат кальция

Тальк

Крахмал картофельный

Составитель Г.Золотарева

Редактор О.Юрковецкая Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Т.Малец

Заказ 4051 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35,. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Количество клеток в 1 мг 0,9%-ного раствора

NaCl

8,5 10

8,5 10

8,5 10

8,5 105

8,5 10

8,5 10

8,5 10

8,5

+44

+v+

+++

++

++

++

+

+++

4-++

+++ н

++

++

+

+++

+++

+н

++

++

++

+

3

1

4

2

+++

+++

++

++

++

Нет роста

0;0;0

0;0;0

0;0

++О+

О+

+О

+О

+++

4++

4Н

++

++

++

+

Питательная среда на основе мясопептонного бульона

++

++

++

+

0;0:0, -0;0;0

0;О

++О+

+О

+О