Способ определения адгезии лейкоцитов
Изобретение относится к клинической иммунологии, а также для диагностики специфической сенсибилизации лейкоцитов у обследуемых лиц. Целью изобретения является повышение точности способа. Способ осуществляют путем инкубирования цельной крови с 0,9-1,1%-ным раствором желатины на среде 199 в течение 10-15 мин с последующим выделением лейкоцитов Полученную суспензию лейкоцитов из надосадка осаждают и вносят в лунки планшета в концентрации 1-1,5 млн/мл ядросодержащих клеток в среде 199, затем клетки инкубируют 1,5-2 ч при рН 7,0-7,2 с после,- ющей промывкой и дозированием. Определение адгезии проводят по активности миелопероксидазы в прилипших клетках. Для этого в лунки планшета дополнительно вносят смесь ортофенилендиамина и перекиси водорода в соотношении (98-102) 1, после чего снимают показатель оптической плотности, пропорционально соответствующий количеству прилипших клеток. Способ является значительно более точным. Положительный эффект способа дает возможность значительно повысить точность метода и сократить время его выполнения.
союз сОВетских
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (51)5 6 01 М 33 =3
1 зом.. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4769601/14 (22) 09.11.89 (46) 07.12.91. Бюл. ¹ 45 (71) Институт иммунологии (72) M.Ç.Ñàèäîâ и Б.B.Ïèíåãèí (53) 615.375 (088,8) (56) Пинегин Б.В., Ковальчук Л,В., Еремина
О.Ф. С андартные методы иммунологического обследования по тестам первого уровНЯ. 1 1етодологиЯ, орГанизациЯ и итоги массовых иммунологических обследований. — M., 1987, с. 234 — 243, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИИ
ЛЕЙКОЦИТОВ (57) Изобретение относится к клинической
° иммунологии, а также для диагностики специфической сенсибилизации лейкоцитов у обследуемых лиц. Целью изобретения является повышение точности способа. Способ осуществляют путем инкубирования цельИзобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано при диагностике специфической сенсибилизации лейкоцитов у обследуемых лиц, Целью изобретения является повышение точности определения адгезии лейкоцитов крови.
Способ осуществляют следующим обраЛейкоцитарную взвесь из цельной гепаринизированной крови получают путем осаждения эритроцитов 0,9 — 1,1;4-ной желатиной на среде 199. Выдерживают смесь
10 — 15 мин при 37 С. Отбирают надосадок, Суспензию, находящуюся в надосадочной жидкости, отмывают в режиме 200 g в течение 10 мин и 0,05--0.15 мл клеточной взвеси ной крови с 0,9 — 1,1 /.-ным раствором .><елатлны на среде 199 в течение 10 — 15 мин с последующим выделением лейкоцитов.
Полученну.о суспензию лейкоцитов из надосадка осаждают и вносят в лунгки планшета в концентрации ", 1.5 млн/мл ядросодержащих клеток в среде 199, затем клетки инкубируют 1,5 — 2 ч при рН 7,0-7,2 с после,,— ющей промывкой и дозированием. Определенле адгезии пооводят по активности миелопероксидазы в прилипших клетках.
Для этого в лунки пганшета дополнительно вносят смесь ортофенилендиамина и перекиси водорода в соотношении (98-102):1, после чего снимают показатель оптической плотности, пропорционально соответствующий количеству прилипших клеток. Способ является значительно более точным. Положительный эффект способа дает возможность значительно повысить точность метода и сократить время его выполнения. на среде 199 в концентрации 1-1,5 млн/мл помещают в лунки плоскодонных пластин для иммунологических реакций. Пластины предварительно обрабатывают средой 199 в течение 30 мин.
Планшеты инкубируют в течение 1,5 — 2 ч при 37 С в присутствии 5;ь СО2, или буферного раствора(ХЕПЕС) для создания рН 7,0—
7,2, По окончании инкубации содержимое лунок трижды промывают средой 199 и последний раз бесцветным физиологическим раствором (рН 7 — 7,2) для удаления остатков красителя, Количество прилипших клеток определяют путем тестирования активности фермента МП, содержащегося в азурофильных гранулах этих клеток, С этой целью в лунки
:(<(70 !1 8 добавляют 0,1-0,15 f J H,) О, (в! !де)(и<ив(:.:,:.",т:! течение 15 — 2C мин, Зе". 6НТ в=!!",::.)с)!=c »!<.Веется в жидку)О среду, всг,:."=;-(сгнив -и: !!зтического лизиса клето!<,.Jio :, riя.;-,.: . ::I . OE f ную смесь, состоя цу!о из г -:3(". .- -.- -;-.:-.;— ;-;;-;;з
Орто<3(енилендиам!()н 3 и:, О, " д -Го;з:зс" во: 3
) 1Ю2(f(pM (лх соотнош(. )!!и!i (l ..):., ),с (.. ( (ОРД на фосфат-цитратнс(м б.(<гар:-:;,.: !- 5,0, По истечении 5 — 1О млн -р!3акц(х)я с(:.,Ганав -: вается добавлением (4 Н;ЛО4, оп ги()еск((:;з
ПЛОТНОСТЬ,,")еаКЦИОНЧО ::. f:I(!6<:È С.)- И(()а,!З-- мнОГОKанальнОМ сГ)ектi)о(с(о о!!6T:, а
MUlTlgl Р1)зз. Резуль:аты о!- . чес::о(7 плотности, соответст;(J!<)((Ei! I а „":;.:.";,- ., -!!з(. -.. исследуемой )((1! В п)риг(ипшн)х клЯт -";* ;„ I(6(("- .водят В ус.ед. актив(-10(зт,I Фе() !Рнте пе joксидаз ы хрена (удельная =" I:TM 6Hoc T::-i,".:.:",!.(--„ :.! ( ед/мг).
ДЛЯ ПОСТРОЕНИЯ С-Гс(!-! Ца)З .НОЙ Кали(ЗРОвочной кривой испОльз, I-:;т!:i пoi !("(:)Вл.=(нн ы Й раствор перекс!! дезы х;зена с изВестной кОнцентбецией зт(зГ(! феом -! 176 аКТИВНОСТЬ ЭТОГО фЕ:Pi Ента Ге(ЗТЗЗ((((:= (ЗЯ Е! той же реакц )QHHQA с!истек .6, !.",Tа. д;)!) 3!-ую кривую строят, откладыв я;-)з ск;=(б)<.цисс; весовые количества г)6:.зс)к(:,! ..:ьаз!:.! хпе-!а,;.:;
Г)0 Оси ОРДинат coQTBBTO; P,,!c(Jl JI!j i,; ..""..*, :;о;!",т!,"ЧЕСКУЮ ПЛОТНОСТЬ.
Объектом исследования сл «< .,:- Ге!за р);.— низированная кровь, пс!))(!6H:- ;=я:::з вен=! в количестве 10 мл. Далее получен:-..- .;-. К,зовь делят на 10 г)орци(л по . Мл . про одят 10 параллельных исследова!!(И!)), О цепьfc(разделения клеток белой крови от (ри . ц:,- o;( кРОвь смешиаают с О,с! (г,-ным:.-.=,;.. о н;,, желатина на питатегьной с" еле l .) 37оC ВВВШИЙСЯ BepKHMA CJiOA, С(СТС;Г!Ц(! .I :-;O„;„ -!. !((ЩЕСТВЕННО ИЗ ЛЕйКЗЦИ. " :Á=,, 3 (З!()С; — (.-а;! Ггг И отмывают от желат, на и:з3: )ООР j ;,,".течение 10 мин. После отмывания к,<летка!,(дзбаа)!3 ":., мл среды 199 или с!баг),:-:нс«)ревеня згii левого Раствора. П аво,,vT c!6-. Кга-::a( краске сг)еду)ощего состава, .4: г,".)-. :!тон-Х l00 0,2; зозин О, 1; азур ! Вс)с((з;за::-..- с;!" и мы, 0,015; Н20 д(з 100 (разведение г!!Toчно"i суспензии (. О), Диф<)зеранцированный счет проводят в камере Горяева с, учетом формы ядра, что ПОЗВС ЛЯет В,IE!6CTM П,ЗОЦ6НТ ПОЛИНУКЛЕВРн (- х If; l)I o I- (з ь! ((к л е а г .-! ь;< !<ë 6 то к„н а р я ду:„" а б; О Л (К) т Н Ь((4 (С! Л ((Ч 6 С т В З (г Л а и К О Ц И т О В И :-! (ай гро®и! (о в, В г)унхи пло(скодоннь!), Пг)аншет для иммунологических =еакц(лй вносят 0,1 мл исЗЛЕДУВМОй КлатОЧНОй ВЗВЕСИ .; Кг)НЦЕНтРВ! (,ай 1 1!О нейтрофиловумл. Далее планшеты к!!Куб(иру,о в течен !6 1.5 ч при 37"С в и в (! с .,(т ст в и и 5 "г((((., О, П с о к о н ч а н (А и N H I )(á ýi,. (И СОДВРЖИМОЕ ПУНОК тг)ИжДЫ ПРОМЫВВЮТ ,-!).,,oй .сзс и поспедний раз бесцветным фи;Гиологичезн(л! раствором РН 7,0 для удал(ания остэткo!3 красит6л! -., Затем в лунки добавляю О, IMJ Н2О, выдерживают в течен(ле 20 мин и, !еле(= "внося, Ei.з учки О, 1 )(!f1 смеси, 0.04 г, орт(зфеь иг!6ндиамина на фосфат-цит20 ратном буфере рн 5,0 и 0,02% раствора (12О2 при их соотношении соответственно Оевном )(Р (в I Q 2 мл (ОРД ВносЯТ 0,1 мл !. . Г)2,(Н 2 О 7}. ц! 6 ь! 6:= "5 м и н P 6 B K l3 !((EI G c T (I H 8 f3 ливается добавлением 0,1 мл 1 И НАДБО,, Оп ическунз пг(отность резакU,èoííoé смеси .;-!Имают в -;пектрофо-о!(бтре "lV!uitlshan Р! Ua". Сраенитаг)ьный анализ предлагаемого и извecT.-IOIO спосс)бов г р!)веден в таблице. Способ ()пределения адгезии лейкоци cIE3, включак-.!ЦЗИ(.! их вь(деление л последуюГцее эп!зедеге ие количества приллпших к ;. 5 повеохнос.-:M пластике,<леток, о т л и ч а ю(ц i A с Я тем, )то, с целью повышения :-,:iH ;IoñòM сп зсоба. суспензлю лейкоцитов вносят::-. лунки г!г:аншета в концентрации 1-,,5 i!(H, мл "åé<оцитов, инкубируют l,5 — 2 -,-J3:i пpM рН 7,0--7,2 с; посладунзгцей промывкой . ллзирован: ем, а адгезию определяют по активности миелопероксидазы в прилипших клетках, при зтом B лунки дополнительно BHc(cRT смесь 0,04% раствора -"5 ортофе!-.:.1пе! диам!Иь!а и 0,02;7 раствора пе,"екиси водо )ода в соотношении соответстзаико равно .! (98;102}:1, после чего снимают -((зказатепь с гти-:еской ппотности, пропор(ионально c OTB!=Tc! I)ук) гции кс)лйчестВу :",оип(! (Г) ((((,(х !(Лг т!) к 697008 Составитель Б.Мануйлов Редактор В.Бугренкова Техред M.Ìîðãåíòàë корректор М.Максимишинец Закаэ 4303 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по иэобретенилм и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушскгл наб„4/5 Производственно-иэдательский комбинат "Патент", г. ужгород, ул,Гагарина, 101
