Иммуноферментный способ определения миоглобина в крови

 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунодиагностике, и но-, жет быть использовано а кардиологии, хирургии и клинической медицине для диагностики степени разрушения мышечных клеток. Цель изобретения заключается в повышении точности иммуноберментного способа определения мио глобииа з крови. Сущность изобретения состоит в том, что при иммунсЛерментном анализе исследуемую пробу плазмы, сыворотки или цельной крови предвари- Тельнд смешивают с раствором Формальдегида до его конечной концентрации 3 Мкг/мл и инкубируют в течение 1 ч при 30 С, диалИзуют и добавляют к сорбированным на твердой фазе антителам к ммуноглобулину. Отмывку твррдой фазы после каждой операции осуществляют раствором казеина концентрацией 0,5 мг/мл. Предлагаемый способ поэ иоляет повысить точность определения миоглобина в 7 раз по сравнению с прототипом. 4 табл. Ј с

„„5U.„, 17Î754 1I (51)5 0 01 ! 33, 535

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ASòîpÑÍOM× свиДКтеЛьСтвм

". @ Ф

)ь

СОЮЗ СОВЕТСКИХ ,ф ." 3 С01УАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4426870, 14 (22) 12.05.88 (46) 23.01.92. Бюл. Р 3 (?1) Таджикский государственный универси гет им. R.È.Ëeíèíà Y. Институт сердечно-сосудистой хирургии ин. A.Н.Бакулева (7?) С.П.Смотров, И.Н.Баринова, Д.Б.Сапрыгин, A.Г.Ислам-заде и П.И.Аширов (53) 612.015(088.8) (56) Вопросы медицинской химии, 1986, Р 1, с. 130-134. (54) Ж71УНМ?ЕР1ГНТ%И СПОСОБ ОПРЕДЕ ЛЕНИЯ П10ГЛОБИНА Ч КРОВИ (57) Изобретение относится к медицине, в частности к иммунодиагностик», и мо-, жет быть использовано в кардиологии, хирургии и клинической медицине для

Изобретение относится к медицине, в частности к имм нодиагностике, и может быть использовано в кардиологии, хирургии и клинической медицине для диагностики степени разрушения льппечных клеток.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Способ осуг ествпяется следующим образом.

Очиценными антитепами к миоглобину в концентрации ? > мг мл при рЧ 9,6 в объсме э,> мк <,о>(>а Йы, t ivan>1 .>., »"„-. Ii, эловый планшет для иммунологических реакций при 4 С в течение 18 ч, Одновременно обрабатывают миоглобин-стандиагностики степени разрушения мышечных клеток. Цель изобретения заключается в повышении точности иммуноЬ»рментного способа определения миоглобина в крови. Суцность изобретения состоит в том, что при иммунолерментНоМ анализе исследуемую пробу плазмы, сыворотки или цельной крови предварительно смешивают с раствором 6ормальдегида до его конечной концентрации

3 мкг/мл и инкубируют в течение 1 ч о при 30 С, диализуют и добавляют к сорбировашл ли. на твердой 6азе антителам к ь>чмуыглобулину. Отмывку твердой

Лазы после каждой операции осуществляloT раствором казеина концентрацией а

0 5 мг/мп. Предлагаемый способ поэ ыоляет повысить точность определения миоглобина в, раз по сравнению с прототипом. 4 табл. дарт и пробу крови Ьормальдегидом.

Для этого к 30 мкл миоглобина-стандарта с концентрацией 1 мг, ил добыв— ляют 30 мкл ЗХ-ного раствора *ормальцегида и смесь инкубируют в течение о

1 ч при 30 С. После этого смесь под. вергают диализу против 0,05 M pochaтного бункера рН 7,2 в течение 4060 мин при перемешивании и частой смене диализируюцего раствора. Лналогичным образом к 300 мкл предварительно разведенной í 10 раз пла-. н рдв>п »бы >лп,o" .30 <<>,! 3 7 >>1г» >1ыс вора йормальдегида и сне .ь инкуГ>пр, ют в течение 1 ч при ЗО С. После этоо го смесь диапиэуют против Лоспатного

1707541

50 буфера РН 7,2. Приготовленный таким образом миоглобин-стандарт используют для построения калибровочной кри-, вой, а пробу — для иммуноферментного определения уровня миоглобина.

Пример I. В лунки планшета, содержащие антитела к миоглобину, добавляют обработанный Ьормальдегидом миоглобинсодержащий раствор плазмы 10 крови пациента в объеме 50 мкл на лун ку и инкубируют в течение 40 мин при о

37 С. После отмывки водой лунки обрабатывают 350 мкл раствора каэеина с концентрацией 0,5 мг/мл в 0,01 М 6ос- 15 фатном бункере РН 7,2 в течение 3 мин.

После этого в каждую лунку добавляют по 50 мкл разведенных 1:500 меченых пероксидаэой антител к миоглобину человека и инкубируют в течение 40 мин 20 при 37 С. После отмывки водой лунки о обрабатывают раствором казенка с концентрацией 0,5 мкг/мл н 0,01 И фосфатном буфере рН 7,2 в течение 3 мин.

Определяют пероксидазную активность 25 по общепринятой методике в присутствии хромогена О-фенилендиамина. Время экспозиции составляет 20 мин, а после остановки ферментативной реакции

50Х-ной серной кис"отой.измеряют опти-3р ческую плотность при 492 нм. По результатам оптической плотности растворов-стандартов строят калибровочную, кривую и по ней рассчитывают концентрацию миоглобина в испытуемой плазме крови.

Пример 2. Анализ уровня миоглобина в цельной крови и пробе сыноротки крови пациента пронодят по примеру 1. По результатам анализа уронень40 миоглобина в цельной крови и пробе сыворотки крови составляет 37,9+

«0,9 нг/мл и 38,1 1,0 нгlмл.

Дпя доказательства оптимальности концентрации каэеина в промывочном растворе (0,5 мг/мл) используют результаты измерений холостого опыта.

Этот опыт представляет собой измереwe оптической плотности окрашенного раствора н результате проведения им— муно*ерментного анализа в отсутствии миоглобина. Из табл. 4 видно, что оптимальной и однозначной концентрацией казеина является 0 5 мг/мл, о чем свидетельствует наиболее низкая оптическая плотность раствора в холостом опыте.

Показано, что значения коэРх ициента вариации, характеризующего точ» ность метода, рассчитанные для каждой определяемой концентрации миоглобина, для предла.аемого способа значительно меньше, чем для прототипного. Это указывает на более высокую точность предлагаемого способа. Голее наглядно это видно из соотношения значений этого коэффициента СЧ прототипа/CV предлагаемого) для каждой определяемой концентрации. Это соотношение лежит в пределах 2,55 — 13,31. Среднее значение соотношения составля т 7,65+4,09.

Это говорит о том, что предлагаемым способом можно определить уровень миоглобина с точностью, более чем в 7 раз, превышающей точность известного спосо6а.

Оптимальность предлагаемых параметров способа — концентрации йормальдегида 3 мг/мл, времени обработки формальдегида 1 ч, температуры обрао ботки 30 С вЂ” иллюстрируют табл. 1-4.

Формула изобретения

Иммуноферментный способ определения миоглобнна в крови, включающий сорбцию антител к миоглобину на твердую Ьаэу, инк.убацию с исследуемой пробой крови, добавление меченых пероксидаэой антител к миоглобину, отмывку после каждой стадии, внесение субстрата пероксидаэиой реакции и регистрацию изменения оптической плот— ности раствора, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью повышения точности способа, исследуемую пробу предварительно смешивают с раствором формальдегида до его конечной концентрации 3 мг/ил и инкубнруют н течение о

1 ч при 30 С, диалиэуют и добавляют к сорбиронанным на твердой фазе антителам к миоглобину, а отмывку твердой

Фазы осуществляют раствором казеина с концснтра ней 0,5 мг/мл.

1707541

Таблица 2

Та блица 1

Время обработки, формальдегида, ч

Концентрация формальдегида в растворе, мг/мл

Оптическая плотность раствора при 49". нм для концентрации миоглобина

80 нг/мл, отн.ед.

Таблица 3

Та блица 4! Оптическая плотность раствора при 492 ни для концентрации миоглобина 80 нг, нл, отн. ед.

Температура обработки формальдегида, С

Концентрация казеина, в промывочном растворе,-мг/мл

Оптическая плотность раствора в холостом опы- е при 492 нм, отн.ед.

Составитель А.Скурат

Техред MËoðãåíòàë Корректор М.Самборская

Редактор H.Лазаренко

Заказ 264 ираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.У тород, ул. Гагарп .të, 10 .

1 . Э

12

37

0,68

0,97

1,16

0,84

0 86

0,78

1,53

1,51

1,54

1,85

1 э60

1,38

10 ---g

0,5

2

0i1

0,3

0,5

30 Ов7

0,9

Оптическая плотность раствора при 492 нм концентрации миоглобина 80 нг/мл, откос. ед.

0,8:Ò

1,07

1,18

1,09

1,02

0,97

0,89

О,45

0,31

О,?О

0,19

0,19