Способ выявления антигена менингококка серотипа с

 

Изобретейие относится к биологии и медицине, может быть использовано Для выявления антигенов менингококка С в биологических жидкостях с помощью кодиагностикума. Цель изобретения - упрощение способа и повышение его чувствительности. Сущность изобретения заключается в том, что используют 2%-ный стафилококковый реагент, содержащий белок А, который является иммуносорбентом и одновременно твердофазным носителем. Сенсибилизацию осуществляют асцитной жидкостью мышей , содержащей специфические антитела с титром 1:64. Реакционный комплекс дополнительно обрабатывают кроличьей преципитирующей противоменингококковой сывороткой при рН 7,0. В качестве пероксидазного конъюгата используют антивидовые антитела.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з G 01 N 33/535

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4695271/13 (22) 24.05.89 (46) 30.03.92.Бюл. М 12 (71) Львовский государственный медицинский институт (72) Б.Д.Луцик и В.Б.Ломиницкая (53) 619;616.078 (088.8) (56) Журавлева Г.В. Иммуноферментный метод в диагностике менингококковой инфекции. ЖМЭИ, 1984, N. 9, с. 28 — 29, (54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНА MEН И Н ГОКО ККА СЕРОТИПА С (57) Изобретение относится к биологии и медицине, может быть использовано для выявления антигенов менингококка С в биИзобретение относится к биологии. и медицине и может быть использовано для выявления антигенов менингококка С в биологической жидкости с помощью кодиагностикума.

Известен способ определения антигена менингококков А и С в биологической жидкости на основе прямого метода с применен ием полистероловой пластины как твердофазного носителя, очищенных противоменингококковых антител, а также приго-. товления коньюгата этих же антител с пероксидазой. При постановке иммуноферментного анализа (ИФА) в лунки пластин, сенсибилизированных антителами, добавляют исследуемый материал (спинномозговую жидкость, СМЖ), в которой предполагается наличие антигенов. После отмывки от несвязавшихся белков в лунки

„„5U„„1723525 А1 ологических жидкостях с помощью кодиагностикума. Цель изобретения — упрощение способа и повышение его чувствительности.

Сущность изобретения заключается в том, что используют 2 -ный стафилококковый реагент, содержащий белок А, который является иммуносорбентом и одновременно твердофазным носителем. Сенсибилизацию осуществляют асцитной жидкостью мышей, содержащей специфические антитела с титром 1:64. Реакционный комплекс дополнительно обрабатывают кроличьей преципитирующей противоменингококковой сывороткой при рН 7,0. В качестве пероксидазного конъюгата иСпользуют антивидовые антитела. серологических пластин вносят конъюгат с пероксидазой. Пластины отмывают буфером от несвязавшихся антител и в лунки добавляют раствор 5-аминосалициловой кислоты с перекисью водорода. При наличии в СМЖ менингококковых антигенов в соответствующих лунках серологических пластин появляется окрашивание раствора, интнесивность которого зависит от концентрации антигена.

Недостатком известного способа является необходимость тщательной очистки антител, часть из них необходимо связать с пероксидазой. В данном методе применяется прямой иммуноферментный анализ, что менее чувствительный по сравнению с непрямым методом. Очистка антител и "привязка" пероксидазы довольно сложные процедуры и требуют специальной аппаратуры.

1723525

Цель изобретения — упростить способ и повысить чувствительность.

Указанная цель достигается тем, что антитела из иммунных биологических жидкостей (иммунная асцитическая жидкость, сыворотка крови, моноклональные антитела) адсорбируют стафилококковым реактивом, содержащим белок А.

Существенное отличие предлагаемого способа заключается втом,,что стафилококковый реактив, содержащий белок А, является иммуносорбентом и одновременно твердофазным носителем, Способ осуществляют следующим образом.

Из музейной культуры менингококка серотипа С делают вакцину следующим образом. Взвесь односуточной культуры менингококка в физиологическом растворе в концентрации 1 х 10 микробных тел в

9 . 1 мл прогревают при 60 С на протяжении часа и добавляют фенола до конечной концентрации в 0,25%. Вакцину проверяют на бактериологическую чистоту и делают биопробу на мышах. После контроля проводят вакцинацию безлинейных белых мышей.

Были испытаны различные концентрации вакцины и различные сроки вакцинации. Оптимальным вариантом оказалась доза в 0,1 мл, вводимая через 7 дней внутрибрюшинно шестикратно. Для получения иммунной асцитической жидкости (ИАЖ) через 3 дня после последней иммунизации вводили внутрибрюшинно клетки саркомы

180-TG. Штамм этих клеток поддерживали в пассажах на взрослых мышах путем внутрибрюшинных прививок. От одного животного получали 6 — 8 мл асцита, Титры антител в пуле ИАЖ имел значение в РСК

1;64, При повторных пункциях титр противоменингококковых антител падал. ИАЖ от повторных пункций не использовали.

На следующем этапе к 1 мл ИАЖ добавляли равное количество 2%-ной взвеси стафилококкового реагента, содержащего белок А в 0,1 M фосфатном буфере при рН

8,0. При таких условиях стафилококковый реагент связывал иммуноглобулин ИАЖ. Об этом свидетельствовал электрофоретический анализ ИАЖ, проведенный до и после ее инкубации со стафилококковым реагентом. Электрофорез ИАЖ после инкубации не выявлял 1g 6. Другим подтверждением являлось отсутствие антител в ИАЖ после инкубации со стафилококковым реагентом при постановке PCK. На этом этапе получали кодиагностикум.

Кодиагностикум сохраняли при 4 С в виде 10%-ной взвеси. Способности "иммун30

45

50 торые дешевле кроликов) и применять не55

10

20 ного реагента" кодиагностикум сохранял и через 10-12 мес хранения.

Для выявления предполагаемого антигена, 0,5 мл СМЖ центрифугировали при

3000 об/мин на протяжении 5 мин, К надосадочной жидкости добавляли 1 мл 1%-ной взвеси кодиагностикума и инкубировали смесь при 37 С на протяжении 30 мин, периодически перемешивая. Взвесь центрифугировали при 3000 об/мин, отмывали от несвязавшихся белков фосфатным буфером при рН 8.0. К осадку добавляли 0,2 мл стандартной преципитирующей противоменингококковой сыворотки к серотипу С при рН

7,0; инкубировали 30 мин при 37 С. Осадок снова отмывали от несвязавшихся белков и к осадку добавляли антитела диагностические против иммуноглобулинов кролика меченные пероксидазой хрена (производства

Ленинградского НИИ вакцин и сывороток), В предварительных исследованиях находили оптимальное разведение диагностических антител.. Чаще всего применяли разведение 1:20, Взвесь инкубировали

30 мин при 37 С, отмывали от несвязавшихся белков и обрабатывали проявляющей смесью. Проявляющая смесь состоит из

0,3%-ного раствора перекиси водорода и раствора 5-аминосалициловой кислоты (1 мг на 1 мл дистиллированной воды). Раствор аминосалициловой кислоты доводили до рН

6,0 1 Н гидроокисью натрия (рН 6,0 имеет очень важное значение для выявления пероксидазы). В пробирке с кодиагностикумом, при наличии антигена менингококка серотипа С в СМЖ, будет образовываться коричневый цвет раствора через 10-15 мин после добавления проявляющей смеси. Количественные изменения можно определить на спектрофотометре при длине волны

450 нм. Контролем служит кодиагностикум без СМЖ, а также диагностические антитела, меченные пероксидазой хрена, и проявляющая смесь.

Предлагаемый способ упрощает выявление антигена менингококка серотипа С, так как исключает специальную очистку антител и присоединение к ним пероксидазы, дает возможность использовать мышей (копрямой иммуноферментный анализ (который в 10 раз чувствительнее прямого метода).

Формула изобретения

Способ выявления антигена менингококка серотипа С, включающий сенсибилизацию носителя антителами, внесение исследуемого антигена, добавление перок1723525

Составитель Г.Соболева

Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор Э.Лончакова

Редактор Н,Шитев

Заказ 1062 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035; Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат ."Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 сидазного коньюгата и учет реакции, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения его чувствительности, в качестве носителя используют 27;-ный стафилококковый кодиагностикум, сенсибилизацию осуществляют асцитной жидкостью мышей, содержащей антитела к менингококку серотипа С в титре 1:64. после внесения исследуемого антигена реакционный комплекс дополнительно инкубируют в присутствии кроличьей антименингококко5 вой преципитирующей сыворотки при рН

7,0 и в качестве пероксидазного коньюгата добавляют антивидовые антитела.