Способ определения активности холинэстеразы

 

Изобретение относится к способам определения активности холинэстеразы путем электролиза исследуемого вещества в присутствии субстрата. Повышение экспрессности и удешевление процесса достигаются при использовании графитового электрода, модифицированного низкомолекулярными редокс-соединениями, например тетрациано-п-хинодиметаном, а в качестве субстрата - бутирилтиохолинхлорида. Электролиз ведется в 0,1 М калий-фосфатном буферном растворе, рН 8,0. Активность холинэстеразы определяется по скорости увеличения анодного тока. В результате можно определить активность холинэстеразы в интервале концентраций 0,045-4,5 ед/мл. 1 з.п. ф-лы, 4 табл. Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)л G 01 N 27/333

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

2 4

ЬЭ

00 4

О (21) 4810894/25 (22) 06.04.90 (46) 23.04.92. Бюл. N 15 (71) Институт биохимии Литовской академии наук (72) Ю.Ю.Кулис и А.А.Друнгилене (53) 543.257(088.8) (56) Патент США

N - 4565780, кл. G 12 Q 1/46, 1/26, 1986.

Патент СБА

М 4340667, кл. 6 12 Q 1/46, 1982.

lao Т. Апа!.Chim. Acta, 1983, ч, 153, р.

169. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ

Изобретение относится к способам определения активности ферментов, конкретно к электрохимическому способу определения активности холинэстеразы путем измерения тока, и может быть использовано в промышленности для обнаружения холинэстеразы в средах их выращивания, в мониторинге окружающей среды при установлении ингибиторов холинзстеразы, например токсических фосфорорганических соединений, а также для клинических исследований в диагностических целях.

Известен способ определения холинэстеразной активности, включающий гидролиз субстрата производного п-гидроксибензоилхолина под действием холинэстеразы с образованием и-гидроксибензойной кислоты, реакцию последней с ферментом гидролазой и-гидроксибензойной кислоты в присутствии кофермента никотинамидадениндинуклео„„. Ж„„1728770 А1 (57) Изобретение относится к способам определения активности холинэстеразы путем электролиза исследуемого вещества в присутствии субстрата, Повышение экспрессности и удешевление процесса достигаются при использовании графитового электрода, модифицированного низкомолекулярными редокс-соединениями, например тетрациано-п-хинодиметаном, а в качестве субстрата — бутирилтиохолинхлорида. Электролиз ведется в 0,1 M калий-фосфатном буферном растворе, рН 8,0. Активность холинэстеразы определяется по скорости увеличения анодного тока. В результате можно определить активность холинэстеразы в интервале концентраций 0,045-4.5 ед/мл. 1 з.п; ф-лы, 4 табл. тидфосфата в восстановленной форме (НАДФН). При этом НАДФН окисляется до ни коти намидадениндинуклеотидфосфэта (НАДФ), Об активности фермента холинэстеразы судят или по величине уменьшения экстинкции, или по степени потребления кислорода при превращении НАДФН в

НАДФ.

Недостатком этого способа является применение дополнительного фермента и, других дорогостоящих реагентов, таких как

НАДФН.

Известен спектрофотометрический способ определения активности холинэстеразы, заключающийся в том, что проводят гидролиз субстрата бутирилтиохолина под действием холинэстеразы в присутствии голубого красителя — 2,6-дихлорфенолиндофенола. Бутирилтиохолин при гидролизе высвобождает тиохолин, который непосред1728770 ственно восстанавливает этот краситель, переводя его в бесцветную форму. Изменение поглощения при 600 нм, обусловленное исчезновением 2,6-дихлорфенолиндофенола, прямо пропорционально активности холинэстеразы.

Недостатками способа являются необходимость применения оптически прозрачных проб, длительность способа из-за того, что приготовленные растворы не подлежат хранению, а применяемый реагент 2,6-дихлорфенолиндофенол является канцерогенным веществом, Наиболее близким к предлагаемому является способ определения активности холинэстеразы, включающий приготовление реакционной смеси, содержащей калийфосфатный буфер рН 7,5 и субстрат — ацетилхолин, помещение ее в злектрохимическую ячейку, снабженную рабочим электродом из платины, предварительно химически модифицированной с помощью холиноксидазы (К.Ф. 1.1.3.17), и электродом сравнения, в качестве которого используют насыщенный каломельный электрод, дальнейшее введение в ячейку холинэстеразы, проведение электролиза при потенциале 0,8 В, измерение тока и определение активности холинэстеразы по увеличению анодного тока. Относительное стандартное отклонение составляет +1,8%, Ферментный электрод готовят следующим образом. Платиновую сетку (1х2 см) анодируют 1 ч при потенциале 2,5 В отн, н.к.э. в 0,1 М серной кислоте, кипятят 5 ч с

3-аминопропилтриэтоксисиланом в толуоле и отмывают, На одну сторону обработанной

Pt сетки наносят 6 мкл 20%-ного раствора альбумина, 8 мкл 4%-ной холиноксидазы в

0,1 M фосфатном буфере рН 8,0, 4 мкл 4%ного глутарового альдегида и выдерживают в открытом воздухе 12 ч. Стабильность ферментного электрода 2 мес.

Недостатками способа являются использование драгоценной платины, дополнительного второго фермента холиноксидазы и белка — альбумина, а также длительность процесса из-за трудоемкой обработки платиновой сетки, Способ требует сложной аппаратуры и специальных реагентов: 3-аминопропилтриэтоксисилан и токсичный глутаровый альдегид.

Целью изобретения является увеличе-. ние экспрессности определения и удешевление процесса.

Способ реализуется с использованием графитового электрода, изготовленного из стержня спектрально чистого графита, К одному концу стержня длиной 3-6 мм при помощи серебряного эпоксидного клея приклеивают медную проволоку, другой конец шлифуют наждачной бумагой (250 мкм) и на нем адсорбируют модификатор..Электрод впрессовывается в тефлоновый корпус, 5 В качестве низкомолекулярного редокс-соединения для модификации электрода используют, нап ример, тетрациано-и-хинодиметан (ТЦХМ).

Сущность способа объясняется схемой

10 ферментативной реакции с образованием . тиохолинхлорида + — ХЗ

CgH7C08CH(CHp-Û-CH)C1

15 I Н

-С Н СООН+НЗ-СНуСНу — М СК 5. сн

Образовавшийся тиохолинхлорид реаги25 рует с окисленной формой адсорбированного на графитовом электроде модификатОра, (Мох) с образованием восстановительной формы (Мвос), Последняя окисляется электрохимически при потенциалах редокс-пре" " """ N()Ä+7RSH MÄ,+(RS), Износ 2е « ох

35 При электрохимическом окислении модификатора генерируется анодный ток. Скорость увеличения анодного тока пропорциональна активности холинэстеразы, Пример 1, Определение зависимости

40 скорости увеличения анодного тока б1/0т от концентрации холинэстеразы.

Электрод (диаметром 5,9 мм) модифицируют путем нанесения на поверхность 40 мкл раствора ТЦХМ в толуоле (6 мг/мл). Рас45 творитель упаривают в воздухе в течение 2 ч. После модификации электрод погружают в термостатированную при температуре

25 С стеклянную ячейку с 20 мл 0,1 М калийфосфатного буферного раствора рН 7,0, с

50 помощью полярографа "ОН 105" по 3-электродной схеме определяют остаточный ток, В качестве рабочего электрода используют модифицированный вращающийся графитовый электрод, электродом сравнения слу55 жит насыщенный каломельный электрод, вспомогательный — Pt пластина, В раствор вводится 50 мкл раствора бутирилтиохолин- . хлорида. Уровень стационарного тока почти не изменяется. В ячейку вводится 10 мклраствора холинэстеразы (К.Ф. 3.1.1.8, Перм- .

1728770 ский НИИ вакцин и сыворотки). Наблюдают увеличение анодного тока.

Зависимость скорости увеличения тока от концентрации фермента приведена в табл.1.

Потенциал Е=О;15 В отн. н.к,э., скорость вращения электрода в = 325 об/мин, t=25 С, Концентрация бутирилтиохолинхлорида 50 мкМ.

Аналогично проводят измерения при скорости вращения электрода 1031 об/мин.

Установлено, что результаты измерений неменяются, поэтому определения для всех концентраций фермента проводят при одинаковых скоростях.

Как видно из табл.1, линейность зависимости dl/dt от концентрации фермента наблюдается от 0 до 4,5 ед/мл, При больших концентрациях прямая зависимости dl/dt от концентрации холинэстеразы загибается. Коэффициент корреляции прямой

0,9997, стандартное отклонение 0,021 мкА.

Чувствительность метода начинается с концентрации фермента 0,045 ед/мл.

Пример 2. Определение зависимости скорости увеличения анодного тока от концентрации бутирилтиохолинхлорида (БТХХ).

Электрод изготавливается как в приме ре 1. Определяется зависимость dl/dt от . концентрации БТХХ (табл.2), Потенциал

0,15 В отн. н.к.э„в = 325 об/мин, 0,1 M калий-фосфатный буферный раствор рН

8,0, т=25 С. Концентрация холинэстеразы

4,5 ед/мл.

Как видно из табл.2, линейность зависимости dl/dt от концентрации бутирилтиохолинхлорида наблюдается в интервале от 0 до 100 мкм. При больших концентрациях калибровочная прямая загибается, Стандартное отклонение в линейном участке прямой составляет 0,02 мкА, коэффициент корреляции 0,9917..

Пример 3, Электрод изготавливается как в примере 1. Проводится калибровка электрода по отношению к тиохолину при разных потенциалах электрода, Для этого определяется остаточный ток 0,1 М калийфосфатного буферного раствора и вводится

50 мкл раствора тиохолина в том же буфере.

В течение 30 с устанавливается новый стационарный уровень анодного тока, Зависимость остаточного тока 1,с и тока электрода I от потенциала электрода приведены в табл.3.

Концентрация тиохолина 100 мкМ, Другие условия как в примере 1.

Как видно из табл.3, в интервале от 0,3 до-0,1 В практически можно провести измерения, но оптимальныеусловия обеспечиваются при потенциале 0,15-0,05 В отн. н.к.э., поскольку отношение между током электрода и остаточным током $/N наибольшее при

5 этих значениях потенциала. Ниже укаэанного предела (т.е. — 0,2 В) не наблюдается окисление тиолов. а при потенциале более 0,2 В значительно вырастает остаточный ток, обусловленный побочными электрохимиче10 скими превращениям на рабочем электроде, Пример 4. Определение активности холинэстеразы, Берут 2 мгlмл исследуемого фермента в буферном растворе, Электрод

15 изготавливается как в примере 1. Затем в

0,1 М калий-фосфатный буферный раствор рН 8,0 в присутствии 0,2 мМ бутирилтиохолинхлорида вводят разные объемы раствора холинэстеразы и записывают кинетические

20 кривые изменения тока.

Для вычисления скорости ферментативной реакции устанавливают величину тока. при использовании стандартного раствора тиохолина -0,4 мМ, которая равна 0,220 мкА.

25 При введении в ячейку 10 мкл (20 мкг) исследуемого раствора холинэстеразы изменение тока составляет 0,224 мкА/мин. Тогда скорость ферментативной реакции вычисляется следующим образом: 400 мкМ вЂ” 0,22

30 мкА, x — 0,224 мкА/мин, х = 407,3 мкМ/мин (в 1 л) или 8,14 мкМ/мин в. ячейке 20 мл.

Активность фермента вычисляется по формуле

А, ед/мл=К- Ооц, а Ь где К вЂ” коэффициент, равный концентрации тиохолина, мкМ, которая способствует из40 менению тока в ячейке.1 мкА; а — измеренное изменение тока, мкА/мин, Ь вЂ” степень разбавления исследуемого образца.

45 Например, при введении в ячейку 10 мкл исследуемой холинэстеразы получают

400мкМ = 1818 2

0,22мкА

b=2000, а=0,224 мкА!мин, А, ед/мл=814,5.

Поскольку исследуемый образец содер55 жал 2 мг/мл белка, то удельная активность

А, E /мг=814,5/2=407,3

Аналогично вычислены и другие скорости ферментативной реакции и активности, Данные приведены в табл.4.

1728770

Таблица 1

Таблица 2

Из табл.4 видно, что наблюдается строгая прямолинейность увеличения тока б1/б от активности холинэстеразы. Вычисленные из любой точки активности препарата близки (среднее 404,2 Еlмг белка), Относительное стандартное отклонение 1,26% (в известном способе 1,8 ). Вычисленная удельная активность из построенного калибровочного графика (скорость реакции — количество холинэстераэы) составляет 410 Еlмг, т.е. практически совпадает.

Преимуществом способа является упрощение и удешевление за счет исключения трудоемкой обработки рабочего электрода и применения второго фермента холиноксидазы, белка — альбумина и 3-аминопропилтриэтоксисилана. Уменьшается токсичность способа, так как исключается применение глутарового альдегида. Метод более экспрессивен — в 8 раз сокращается время приготовления электрода (для приготовления модифицированного графитового электрода требуется 2 ч, а для приготовления Pt электрода — 16 ч). Повышается точность определения в 1,4 раза (относительное отклонение в и редлагаемом способе йе превышает 1.26), а в известном — 1.8 P), Формула изобретения

1. Способ определения активности холинэстеразы, предусматривающий приго5 товление реакционной смеси, содержащей

0,1 M калий-фосфатный буферный раствор и субстрат, введение ее в электрохимическую ячейку, снабженную рабочим электродом и насыщенным каломельным электродом, 10 введение в ячейку исследуемого вещества, проведение электролиза с последующим определением искомой величины, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью увеличения экспрессности определения и удешевления

15 способа, в качестве субстрата использован бутирилтиохолинхлорид, в качестве рабочего электрода использован графитовый электрод, химически модифицированный низкомолекулярными редокс-соединения20 ми, электролиз проводят при потенциале

0,15-0,05 В отн. н.к.э., а активность холинэстеразы определяют по скорости увеличения анодного.тока.

2, Способ по и. 1, отл и ч а ю щи и с я

25 тем, что в качестве низкомолекулярного редокс-соединения использован тетрацианоп-хинодиметан, 10

1728770

Таблица 3

Таблица 4

Составитель Ю.Кулис

Техред М;Моргентал

Корректор Т.Малец

Редактор В.Петраш

Заказ 1404 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101