Способ обогащения биологического материала при бактериологическом исследовании на туберкулез

 

Использование: ветеринарная микробиология , диагностика туберкулеза, бактериология обогащения биологического материала. Сущность изобретения: в способе обогащения биологического материала при бактериологическом исследовании на туберкулез предварительно измельченный материал обрабатывают искусственным желудочным соком, содержащим 4% медицинского пепсина Vi 1%-ный раствор соляной кислоты. Обработку проводят в течение 3 ч при постояннЬм перемешивании 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

s А 61 В 10/00, С 12 0 1/02

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

,> 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ®

2 -" ---

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4799912/13 (22) 11.03.90 (46) 23.05.92. Бюл. М 19 (71) Ровенская научно-исследовательская ветеринарная станция (72) В.А.Матуэенко, В.А. Бусол, А.А. Ткаченко, А.Ф.Кочмарский и А.Я.Марциновская (53) 576.8.093 (088.8) (56) Лабораторные исследования в ветеринарии;/Под ред. В.Я,Антонова и П.Н,Блинова. — M., 1971, с. 84-85. (54) СПОСОБ ОБОГАЩЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ПРИ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОМ ИССЛЕДОВАНИИ НА

ТУБЕРКУЛЕЗ

Изобретение относится к ветеринарной . микробиологии и может быть использовано в диагностике туберкулеза.

Наиболее близким по технической сущности к изобретению является способ подготовки биологического материала для бактериологических исследований на туберкулез, включающий измельчение тканей, обработку серной кислотой и тщательное растирание пестиком в ступке.

Недостатком указанного способа является то, что при исследовании лимфатических узлов беэ туберкулезных поражений используется лишь часть измельченного материала, что значительно снижает его диагностическую ценность, так как внутри обрабатываемых кусочков и в неиспользованных частях тканей, доставленных для исследований, может содержаться возбудитель болезни, который не попадает в исследуемый материал.

Цель изобретения — повышение точности способа бактериологической диагностики туберкулеза., Ы,, 1734699 А1 (57) Использование: ветеринарная микробиология, диагностика туберкулеза, бактериология обогащения биологического материала, Сущность изобретения: в способе обогащения биологического материала при бактериологическом исследовании на туберкулез предварительно измельченный материал обрабатывают искусственным желудочным соком, содержащим 4% медицинского пепсина и 1%-ный раствор соляной кислоты, Обработку проводят в течение 3 ч при постояннЬм перемешивании, 4 табл.

Существенное отличие способа в том, что он позволяет максимально высвободить возбудителя из биологического материала, т,е. то его минимальное количество, которое обеспечивает рост микобактериальных колоний на питательных средах и развитие туберкулезного процесса у лабораторных животных, Способ осуществляется следующим образом.

Отобранные лимфатические узлы для исследований тщательно измельчают ножницами и переносят в коническую .колбу (250-500 мл), в которую заливают на одну часть измельченной лимфатической ткани шесть частей искусственного желудочного сока с 4 -ной концентрацией медицинского пепсина и 1%-ной соляной кислоты (PH

1,6-2), нагретого до 35-37 С. Затем в колбу опускают магнитную палочку. Колбу закрывают капроновой пробкой, стявят на магнитную мешалку (ММ-5) и помещают в термостат. Ферментацию проводят при температуре 35-370С в течение трех часов

1734699 при непрерывной работе мешалки (1 тыс. об/мин).

По окончании ферментации содержимое колбы отстаивают в течение 30-40 с и надосадочную жидкость сливают в центрифужные флаконы, которые, в случае открытого центрифужного диска. закрывают пробками, помещают в предварительно дезинфицированную центрифугу и центрифугируют в течение 5 мин, при 4 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливают.

Осадок серо-белого или белого цвета, в зависимости от вида лимфатических узлов животных, объединяют, заливают 6-10 -ным раствором серной кислоты (1:7), тщательно перемешивают стерильной стекляной палочкой и центрифугируют 5 мин при 4 тыс, об/мин.

Надосадочную жидкость сливают, а осадок, представляющий собой сметанообразную массу и составляющий обычно 8 — 9 частей от количества исходного материала (лимфатической ткани), дважды отмывают физиологическим раствором (1:7) тщательным перемешиванием стерильной стеклянной палочкой, соблюдая стерильность с последующим центрифугированием в течение 5 мин, при 4 тыс. об/мин. Затем, после повторного отмывания, надосадочную жидкость сливают с последующим прибавлением к осадку такого количества физиологического раствора, которое обеспечивает набор в шприц тщательно перемешанного осадка, т.е. используемый для дальнейших исследований материал должен представлять собой консистенцию, превышающую по густоте консистенцию молочных сливок, Посев на питательные среды проводят платиновой петлей.

Пример 1. Для исследования влияния способа ферментации на высеваемость микобактерий туберкулеза из биологического материала (лимфатических узлов) от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота из хозяйств с различной зпизоотической ситуацией в отношении туберкулеза и результаты биологической пробы, в сравнении с известным (способ А.П.Аликаевой), исследовали одновременно 40 проб.

Результаты исследований материала по предлагаемому способу и известному представлены в табл. 1.

В результате проведенных исследований установлено, что при обработке способом фермента ции биоматериала с патологическими изменениями, отобранного на секции от трех животных неблагополучных стад, во всех случаях получены культуры микобактерий туберкулеза и одновременно, положительные результаты биологической пробы, При обработке способом

А,П.Аликаевой соответствующие данные по культуральным и биологическим исследованиям установлены в двух иэ трех проб. При исследовании материала без макроскопических поражений от 26 животных, реагирующих на туберкулин, неблагополучных хозяйств положительный результат при культуральных исследованиях получен в пяти (19,2® пробах и при биологических — в

16 (61,5$) пробах, обработанных способом ферментации, а по способу А.П.Аликаевой аналогичные результаты получены, соответственно, в трех (11,5ф>) и в пяти (19,2 ) пробах. При одновременном исследовании обоими способами частей лимфатических узлов, отобранных от реагирующих на туберкулин животных хозяйств, находящихся в режиме благополучия, получен отрицательный результат.

В табл. 2 представлены сравнительные данные сроков появления роста культур ми20 кобактерий туберкулеза на питательных средах.

Из нее следует, что при исследовании биоматериала с туберкулезными поражени25 ями двумя способами начало роста культур отмечается одновременно на 30-й день. При исследовании биоматериала беэ туберкуЗО лезных поражений также не отмечено достоверных различий в сроках появления роста культур микобактерий туберкулеза.

Эти данные также подтверждают отсутствие вли я н ия искусстве н ного желудОчного сока на биологические свойства микобактерий туберкулеза.

Анализ данных исследований каждой пробы вотдельности,,полученных по способу А,П.Аликаевой, не выявляет достоверных различий между культуральными и биологическими результатами. Так, в семи пробах, в которых получен положительный результат на туберкулез по биологическим иссле35

40 же время при исследовании по способу ферментации такой рост отсутствует в 11 пробах, что в 5,5 раз больше, чем по рутинному способу. Эти данные свидетельствуют о том, что повышение результативности разработанного способа отмечается в основном за счет проведенйя биологических исследований, В табл. 3 представлены обобщенные результаты биологических исследований указанных выше проб.

Из нее следует, что если при заражении морских свинок материалом, приготовленным традиционным способом А.П.Аликаевой, в течение трех месяцев наблюдения

r дованиям, рост культур на. питательных

45 средах отсутствует лишь в двух пробах. В то

1734699 пало, начиная с 50 дня после заражения, семь (8,7 ) опытных животных с признаками туберкулеза, то при заражении морских свинок материалом, приготовленным разработанным способом, пало, начиная с 30 5 дня, 15 (18,7ф>), что в два раза больше, чем в первом случае. Особенно показательны эти данные по результатам исследований биоматериала без изменений, полученные от крупного рогатого скота неблагополуч- 10 ных хозяйств. 8 этих пробах число заболевших животных, зараженных материалом по испытываемому способу, увеличивается до

2,2 раэ, а из числа свинок подвергнутых . ветеринарно-санитарной экспертизе, по за- 15 вершении эксперимента — до 5,6 раз.

Во всех случаях наблюдается совпадение результатов бактериологических исследований, полученных по способу

А.П.Аликаевой, с результатами, полученны- 20 ми при исследовании по способу ферментации.

Пример 2. Для изучения возможного влияния желудочного сока на вирулентные свойства возбудителя проведено исследо- 25 вание шести культур микобактерий туберкулеза, полученный от трех проб материала, обработанных по способу А,П.Аликаевой и ферментации одновременно. Для этого проведено заражение морских свинок 0,1 мг 30 суспензии микобактерий туберкулеза каждой иэ полученных культур по указанным способам, Результаты показывают, что все животные, зараженные культурами, выделенными способом ферментации и А.П.Али- 35 каевой, погибают в течение трех месяцев, При этом, из числа животных, зараженных культурами, выделенными по способу

А.П.Аликаевой, морские свинки погибают в течение 56,8 +- 5,7 дней, а по способу фер- 40 ментации — 60,0 9,4 дней (Р> 0,05). Это свидетельствует об отсутствии какого-либо влияния искусственного желудочного сока на вирулентные свойства изучаемых культур микобактерий туберкулеза. На зто ука- 45 зывают и результаты исследований, приведенные в таблице 3.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что лизис биоматериала, представленного для исследований. 50 способствует высвобождению микобактерий из тканей лимфатических узлов, обогащению ими осадка при центрифугировании.

В связи с тем, что для получения положительного результата биологической пробы 55 на морских свинках достаточно пяти микобактерий туберкулеза, а для роста культур на питательных средах 20 — 100, объясняется повышение достоверности ферментативного способа и, следовательно, то, что по биопробе туберкулеза устанавливается в более частых случаях, чем при культуральных исследованиях этим же способом. Более достоверное различие в совпадении биопробы с культуральными исследованиями при использовании способа ферментации, в сравнении с контрольным способом, свидетельствует именно о высвобождении и наличии того минимального количества возбудителя в 1 мл исследуемого материала, которое вызывает туберкулезный процесс у морских свинок, в то время как культуральные исследования дают отрицательные результаты. Этого не наблюдается при исследовании традиционным способом, где высвобождается, вероятнее всего, такое число микобактерий, введенных морским свинкам, которое в большинстве случаев обеспечивает и появление роста культур микобактерий туберкулеза на питательных средах.

В табл, 4 приведены обобщенные данные сравнительной эффективности культуральных и биологических исследований каждой пробы двумя способами, Иэ нее следует, что по разработанному способу положительные результаты бактериологических исследований на туберкулез получены в 47,5, а по традиционному, широко применяемому в ветеринарной практике способу — в 17,57; пробах биологического материала, что в 2,7 раза меньше, чем по предложенному, Применение в разработанной методике искусственного желудочного сока, магнитной мешалки существенно облегчает технический труд специалистов, позволяет в дотоверно большем объеме использовать материал, поступающий для исследований.

Таким образом, использование предлагаемого способа. позволяет повысить эффективность результатов бактериологических исследований биологического материала (лимфатических узлов) в 2,7 раза, что, в свою очередь, дает возможность повысить точность диагностики туберкулеза. Это достоверно повысит эффективность диагностики болезни и во многих случаях предупредит широкое распространение туберкулеза животных.

Формула изобретения

Способ обогащения биологического материала при бактериологическом исследовании на туберкулез, включающий взятие лимфотической ткани с последующим иэмельчением, обработкой раствором серной кислоты и гомогенизацией, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения частоты высеваемости микобактерий, из1734699

Таблица 1

Примечание: Ф вЂ” исследовано по способу ферментации; А — исследовано по способу

Ал и каевой (прототип). таблица 2

Примечание. Ф- исследовано по способу феомектацим, А- исследовано по способу Аликаевой. „ мельченный биологический материал дополнительно обрабатывают искусственным желудочным соком, содержащим 4 -ный медицинский пепсин и 1 -ный раствор соляной кислоты, причем обработку. проводят

3 ч при постоянном перемешивании.

1734699

Та б пи ца 3

Сравнительные результаты сроков гибели и ветеринарно-санитарной экспертизы павщих и убитых морских свинок

Исследуемый материал

Пало в течение 3 нес. с туберкулезниии поражениями

Исследовано проб

Убито по истечении

3 нес. в тон числе на день

61-70 7!

30-40 41-50 51-60 установлены изменения всего

Ф А Ф А Ф A

Ф А

116

43 51 19 5

9 4 - 1 2 ь к

15 7

12

1 - - 2 2 без изнемений

8 4 - 1 2

104

22 22

65 73

Из благ.хозяйств

44

160

11

ИТОГО

19 5

9 4 - 2

2 - - 2 2

15 7

П р и м е ч а и м е! 4 - исследовано по способу Фернентации; А - исследовано по способу Аликаевой, Таблица 4

П р и м е ч а н и е: Ф вЂ” исследовано по способу ферментации: А- исследовано по способу Аликаевой.

Составитель В. Матузенко

Редактор И. Ванюшкина Техред M.Mîpãåíòàë Корректор О. Кравцова.

Заказ 1760 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при.ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Из не бла гополучных пунктов ° всего е тон числе: с изменени. лмм

Число заравенкых морских свинок

4 2 .

1! 5

2 4 2 2

4! 47 17 3