Способ получения щелочной фосфатазы

 

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: ферментный препарат щелочной фосфатазы получают из содержимого кишечника млекопитающих экстракцией липидов раствором хитозана при его концентрации 0,01 - 0,4% при pH 5,5 - 10,5 и температуре 0 - 45С осаждением этанолом при конечной концентрации 60 об. % и хроматографическим разделением на иммобилизованных моноклональных антителах против щелочной фосфатазы тюленя, секретируемых гибридными клетками АРР. 1. Элюирование проводят при pH 11.3. Удельная активность щелочной фосфатазы равна 19100 - 20800 ед/мг белка, выход по активности 120 - 130% .

Изобретение относится к области получения очищенной щелочной фосфатазы животного происхождения, которая находит применение в генной инженерии, иммуногистохимических процедурах и иммуноферментном анализе, научно-исследовательской работе. Прототипом является способ получения щелочной фосфатазы, заключающийся в следующем. Ферментный препарат получали гомогенизацией тонкого кишечника тюленя, после чего экстрагировали раствор н-бутанолом при соотношении ферментный раствор - органический растворитель 1: 1 (об), а затем осаждали при 4^оС в течение 30 мин этанолом при конечной концентрации 55-65 об. % . Хроматографическое выделение фермента осуществляли на иммобилизованных моноклональных антителах против щелочной фосфатазы тюленя, секретируемых гибридными клетками АРР. 1. Элюирование проводили растворами с рН 9,5-11,5. В результате получили препарат щелочной фосфатазы с удельной активностью 19000-20800 ед. на 1 мг белка. Выход составил 90-94% . Недостатком этого способа является использование такого органического растворителя, как н-бутанола, соединения как малодоступного, так и экологически вредного. Кроме того, способ не позволяет добиться более высокого выхода очистки, хотя получаемые значения не являются предельными. Целью изобретения является повышение выхода очистки и технологичности процесса за счет изъятия из процесса н-бутанола. Поставленная цель достигается тем, что к содержимому кишечника млекопитающих добавляют раствор хитозана, доводя его конечную концентрацию до 0,01-0,4% , и проводят экстракцию при 0-45^оС при рН 5,5-10,5. Нерастворимый комплекс отбрасывают , а из полученного раствора осаждают искомый фермент этанолом при его конечной концентрации 60 об. % . Хроматографическое разделение осуществляют на иммобилизованных моноклональных антителах против щелочной фосфатазы тюленя, секретируемых гибридными клетками АРР. 1. Элюирование проводят при рН 11,3. Данный способ позволяет получать препараты щелочной фосфатазы с удельной активностью, равной 19100-20800 ед/мг белка, выход по активности 120-130% . В предложенном способе удалось заменить н-бутанол на водный раствор хитозана на стадии экстракции липидов без потери активности щелочной фосфатазы при одновременном повышении выхода до 120-130% . П р и м е р 1. К 50 мл содержимого кишечника оленя добавляют раствор хитозана, доводя его конечную концентрацию до 0,4% , и проводят экстракцию при 45^оС при рН 7,5 в течение 0,5 ч. Нерастворимый комплекс отбрасывают, а к полученному раствору при перемешивании добавляют этанол (4^оС) до конечной концентрации 60 об. % , выдерживают 30 мин при 4^оС, и осадок центрифугируют. Полученный осадок растворяют в 20 мл 0,02 М трис-НСl, рН 7,4, содержащем 10 мМ МgCl₂ и 0,5 М NaCl. Раствор наносят на колонку (V = 10 мл) с иммобилизованными на ВrCN-активированной сефарозе моноклональными антителами, секретируемыми гибридными клетками АРР. 1 (коллекция клеточных культур Института цитологии АН СССР, Ленинград, номер 377Д), предварительно уравновешенные тем же буфером. После нанесения фермента гель отмывают 0,02 М трис-НСl, рН 7,4, содержащем 10 мМ МgCl₂ и 0,5 М NaCl до А₂₈₀, равной 0,03-0,05. Фермент элюируют 0,05 М триэтиламином, рН 11,3. Активные фракции объединяли и определяли ферментативную активность по отношению к п-нитрофенилфосфату. Данный способ позволяет получить препарат щелочной фосфатазы с удельной активностью, равной 19100 ед/мг белка, выход по активности 125% . П р и м е р 2. К 50 мл содержимого кишечника тюленя добавляют раствор хитозана, доводя его конечную концентрацию до 0,2% , и проводят экстракцию при 0^оС при рН 5,5 в течение 0,5 ч. Нерастворимый комплекс отбрасывают, а полученный раствор затем обрабатывают, как описано в примере 1. Данный способ позволяет получить препарат щелочной фосфатазы с удельной активностью, равной 20800 ед/мг белка, выход по активности 130% . П р и м е р 3. К 50 мл содержимого кишечника быка добавляют раствор хитозана, доводя его конечную концентрацию до 0,01% , и проводят экстракцию при 4^оС при рН 7,5 в течение 0,5 ч. Нерастворимый комплекс отбрасывают, а полученный раствор затем обрабатывают, как описано в примере 1. Данный способ позволяет получить препарат щелочной фосфатазы с удельной активностью, равной 19100 ед/мг белка, выход по активности 121% . П р и м е р 4. К 50 мл содержимого кишечника тюленя добавляют раствор хитозана, доводя его конечную концентрацию до 0,05% , и проводят экстракцию при 20^оС при рН 10,5 в течение 0,5 ч. Нерастворимый комплекс отбрасывают, а полученный раствор затем обрабатывают, как описано в примере 1. Данный способ позволяет получить препарат щелочной фосфатазы с удельной активностью, равной 20000 ед/мг белка, выход по активности 120% . Таким образом, технико-экономический эффект предлагаемого способа заключается в повышении выхода очистки и технологичности процесса за счет замены органического растворителя на водный раствор хитозана. Это позволяет создать простой и легко масштабируемый процесс выделения и очистки щелочной фосфатазы млекопитающих при небольших затратах материалов, рабочего и технологического времени и сырья. (56) Авторское свидетельство СССР N 1713265, кл. С 12 N 9/16, 1990.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ, включающий экстракцию липидов из животного сырья, осаждение фермента из экстракта этанолом и очистку его аффинной хроматографией, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в качестве сырья используют содержимое кишечника млекопитающих, а экстракцию липидов осуществляют добавлением раствора хитозана до конечной концентрации хитозана 0,01 - 0,4% при рН 5,5 - 10,5 и температуре 0 - 45^oС.