Способ очистки синтетических [8-аргинин]вазопрессина или окситоцина

 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии. Сущность изобретения состоит в очистке на колонке при использовании в качестве носителя сополимера 1-винил-2- пирролидона с N.N-диметакроилгексаметилендиамином {Шг-сн сн с Нз)--N4 с оснъ ° NH(cH2)6NHCo-c-- сн2-сн2Јн сн I 2 где I 0.92-0,94; k 0,06-0,08, диаметр набухших гранул 50-125 мк. Цель - упрощение процесса очистки, увеличение срока службы носителя. Рабочая колонна находилась в 0,2 н. СНзСООИ 2 года, проведено 12 очисток без изменения структуры носителя. 2 табл. %1 VJ СЛ

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю С 07 К 7/16, 1/14

Ъ,ИФ . Х » « 7

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

") 1"" сф (;: (.- юу.

" ... ) 1у<ДЯ "я,с с, Дф)ТЩ i$»

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕЙИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4844581/04 (22) 29.06.90 (46) 15.07.92. Бюл. М 26 (71) MocKoecK A vHcmTyT ToHKoA ской технологии им. М. В. Ломоносова и

Научно-производственное объединение

"Биолар" (72) Г, А. Желтухина, Н. А. Резцова, Р, П. . Евстигнеева, А. П. Павар, А. Х. Зицманис и

Е. И. Филиппович (53) 547.964.4,07(088.8) (56) Папсуевич О. С.,Чипенс Г. И. и др. Нейрогипофизарные гормоны. — Рига: Зинатне, 1986, с, 16 — 34.

Шредер Э. Любке К. Пептиды. — М.: Мир, 1969, т, II, с. 76 — 77.

Oonald Jamashira. Partition

chromatîgãàðhó of 0xltocln on Sephadex.—

Nature, 1964, 201, N. 4914, р. 76 — 77.

Папсуевич О. С, и др. Синтез окситоцина.-Химия природных соединений, 1988, М

3, с. 433-439.

Manning M. The purification of slntetlc

oxitocin and analogs by це filtration on

Sephadex. — J. Chromatogr. 1968, +8, N - 3, р.

396-398.

Патент США М 3728290, кл. 260-2.5, опублик. 1978.

Изобретение относится к химии природных соединений, а именно способам очистки синтетических коротких пептидных гормонов-нонапептидов (8-аргинин)вазопрессина или окситоцина, используемых в медицине и ветеринарии, Основными фармакологическими свойствами (8-аргинин)вазопрессина являются регуляция водно-солевого обмена и антидиуретическая активность у позвоночных, повышение кровяного давления у . млекопитающих, Окситоцин обладает спо,,5U,, 1747456 А1 (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ СИНТЕТИЧЕСКИХ (8-АРГИНИН)ВАЗОПРЕССИНА ИЛИ ОКСИТОЦИНА (57) Изобретение относится к медицине и ветеринарии. Сущность изобретения состоит в очистке на колонке при использовании в качестве носителя сополимера 1-винил-2пирролидона с N,N-диметакроилгексаметилендиамином сн; снЯсн;с(сн,) j-„——

N мн(ск,)рнсо-с ——

СН2 — СН2

CH 9 где 1 = 0,92 — 0,94; k ==0,06-0,08. диаметр набухших гранул 50-125 мк. Цель — упрощение процесса очистки, увеличение срока службы носителя, Рабочая колонна находи- 2 лась в 0,2 н. СНЗСООИ 2 года, проведено 12 очисток без изменения структуры носителя.

2 табл, собностью к сокращению гладкой мускулатуры матки у млекопитающих и усилению .

° певй лактации.

Синтетические (8-аргинин)вазопрессин. . или окситоцин; полученные как твердофазным, так и классическим методом в растворе обычно содержат балластные вещества в виде солей, а также примеси пептидов, образуемые как побочные продукты синтеза.

Однако для применения в медицине и для медико-биологических исследований необходимы гомогенные высокоочищенные пре1747456

55 пзрэты (8-аргинин)вазопрессина и окситоцина. Обычно очистка (8-аргинин)ваэопрессина или окситоцина осуществляется в несколько стадий. На первой стадии — обессоливания — происходит отделение от солей и лишь в небольшой степени от примесей пептидной природы, на второй и последующих стадиях — от пептидов, загрязняющих целевой продукт и значительно снижающих биологическую активность пептидного гормона.

Для очистки синтетических (8-аргинин)ваэопрессина или окситоцина от примесей пептидной природы известно использование противоточного распределения, заключающегося в многократном распределении вещества между двумя жидкими фазами, Недостатком данного метода является необходимость использования доротостоящего оборудования и сложность технологического процесса. Достичь существенной очистки и высокого уровня биологической активности можно только при значительном количестве переносов, а именно, для (8-аргинин)вазопрессина — 198, (а для окситоцина — 300. При этом используются значительные объемы органических растворителей.

Известен также способ очистки синтетического окситоцина путем распределительной хроматографии на сефадексе G-25, который осуществляется при элюировании веществ на .хроматографической колонке смесью растворителей, Недостатком данного способа является то, что воспроизводимые и удовлетворительные результаты очистки получены лишь при использовании многокомпонентной смеси бенэола, бутанола, пиридина, уксусной кислоты и воды. Кроме того, четырехстадийнэя подготовка носителя к работе приводит к длительному (5-6 дней) циклу очистки и требует значительных объемов растворителей. Вследствие образования двухфазной системы на хроматогрэфической колонке необходимо использовать избыточное давление, а колонку периодически перебивать для предотвращения высокого сопротивления носителя.

Наиболее близким к предлагаемому является способ очистки синтетических (8аргиний)вээопрессина или окситоцина от примесей пептидной природы гель-фильтрацией на колонке с сефадексом 6-15 при элюировании 0.,2 н.уксусной кислотой. Подготовка к работе и регенерирование сефадекса осуществляется длительное время

50$-ной уксусной кислотой, 5

Однако такая обработка декстрановых носителей, в частности сефадексов, нежелательна из-зэ их ограниченной устойчивости в сильнокислой среде. В этих условиях происходит химическая деструкция сефадекса, его частичное растворение и загрязнение продукта, Кроме того, хранение сефадекса в рабочем состоянии в водном растворе невозможно вследствие легкости разложения его микроорганизмами, а использование антисептика или хранение при пониженной температуре требует дополнительных материальных и энергетических затрат. Сефадексы обладают ограниченной механической прочностью, что ограничивает применение избыточного давления. Этот фактор, э также значительная длина колонки, например, для очистки окситоцина длина колонки составляет 110 см, явственно снижают технологичность процесса.

Цель изобретения — упрощение процесса очистки синтетических пептидных гормонов (8-эргинин)вазопрессина или окситоцина от примесей пептидной природы, Поставленная цель достигается тем, что в качестве носителя предлагается использовать гидрофильный полимер на основе 1винил-2-пирролидона со свойствами, позволяющими преодолеть недостатки сефадекса, т.е. повысить устойчивость к кислым средам, Сополимеры 1-винил-2-пирролидона с

N,N -метиленбисакриламидом, а также моI дификации этого полимера различными Nзам еще н ными низшими алкилами метакриламидами используют для гельфильтрации белков. Однако они не применяются для очистки олигопептидов.

Согласно предлагаемому способу для очистки нонапептидных гормонов (8-аргинин)вазопрессина или окситоцина гельфильтрацией используется в качестве носителя сополимер 1-винил-2-пирролидонэ с И.N -диметэкроилгексаметилендиамиI ном формулы

1747456 где I = 0,92-0,94 k = 0,06-0,08, фракцию с пониженным содержанием целедиаметр набухших гранул полимера 0,05 — . вого гормона после очистки окситоцина для

0,125 мм, Элюирование проводят 0,2 н.ук- ветеринарии препаративной ВЭЖХ на носусной кислотой, регенерирование ситце Силасорб С1я. Характеристики исносителя — 50 -ной уксусной кислотой. 5 ходных и очищенных по предлагаемому

Данный способ позволяет осуществить очи- способу продуктов приведеныв табл, 2. стку (8-аргинин)вазопрессина или оксито- . Известно, что вазопрессорная активцина от примесей пептидной природы по ность очищенного(8-аргинин)вазопрессина стандартному циклу, приведенному в табл. составляет 470+20 ME/мг, очищенный окси1 ° 10 тоцин обладает биологической активноРабочая хроматографическая колонка nbe 480МЕ/мг,Всоответствиис табл,2 пони-. находилась в 0,2 н.уксусной кислоте в тече- женная биологическая активность для (8-арние двух лет. За это время на ней успешно гинин)вазопрессина составляет -22о,для проведено 12 делений (8-аргинин)вазопрес- . окситоцина -25,5О-. значение угла удельного сина и окситоцина практически без измене- 15 вращения связано с невысоким содержаниний структуры носителя, условий и ем целевого пептида в исходных образцах. результатов очистки, с хорошей воспроиз- В результате очистки по предлагаемому водимостью результатов.. способу наблюдается улучшение физико-хиПредлагаемый полимер не подвергает- мических характеристик продуктов и полся разрушению микроорганизмами в вод- 20 учают практически индивидуальные по ной среде при комнатной температуре, не. ВЭЖХ продукты с биологической активнотребуя дополнительных материальных и стью, аналогичной прототипу. энергетических затрат, связанных с исполь- Индивидуальность веществ контролизованием антисептика или хранением при: ровали тонкослойной хроматографией напониженной температуре. Не наблюдается 25 пластинах Силуфол в системах (соотноше-его химическая деструкция в сильнокислой ния обьемные): среде и связанное с этим загрязнение про- 1) н-пропанол — вода, 25 -ный аммиак дукта, что позволяет применять многократ- 6:1;3; но регенерацию 50 -ной уксусной 2) н-бутанол — пиридин-уксусная кислокислотой. Полимеры на основе 1-винил-2- 30 та-.-вода 15:10:3:12; пирролидона обладают более высокой ме- 3) н-бутанол — уксусная кислота-вода ханической прочностью по сравнению с 3:1:1; сефадексами, при использовании избыточ- 4) пиридин — уксусная кислота — вода ного давления не происходит механической 50:30:15; деструкции полимера. Согласно предлагае- 35 5) н-бутанол — уксусная кислота — вода мому способу применяется колонка длиной 4:1:5 (верхняя фаза); в 28,5-47,5 см, что повышает технологич- 6) н-бутанол — уксусная кислота — вода ность метода. 4:1:1, Исходные вещества (8-аргинин)вазоп- В Э ЖХ на колонке $егчасй гопы рессин и окситоцин синтезировали класси- 40 Sl:100:Polyol RP8 (250х4,6 мм), размер часческим методом в растворе. Отщепление тиц5мкм, элюент0,057,-наятрифторуксус- бензильной защиты сульфгидрильной груп- ная кислота, градиентацетонитрилаот15до пы цистеина в обоих случаях осуществляли 30;, и на колонке Ultrasphere Octyl (250х4,6 натрием в жидком аммиаке. На этой стадии мм) элюент 0,05 M KH2P04, градиент ацетоиз-за жесткого воздействия образуется зна- 45 нитрила от 10 до 60 g, детектирование про-. чительное количество примесей в результа- водили при длине волны 226 нм. Величины

te разрушения пептидных гормонов. Для углов удельного вращения определялись на образования дисульфидной связи (8-арги- поляриметре Perkln — Elmer241mc. нин)вазопрЕсгина использовали феррициа - Пример 1. Очистка (8-аргинин)вазопнид калия, циклизацию окситоцина 50 рессина. осуществляли Н2О2 Большую часть приме- Раствор 90 г (8-аргинин)вазопрессина с сей, образующихся на этой стадии в резуль- ваэопрессорной биологической активнотате межмолекулярного окисления стью 324 МЕ/мг, в 0,8 мл 0,2 н.уксусной составляют изомерные димеры. Получен- кислоты наносят на колонку16х47смс сопо-, ные (8-аргинин)вазопресссин или оксито- 55 лимером 1-винил-2-пирролидона с N.N äèцин обессоливали на амберлите ЯС-50 (H ), метакроилгексаметилендиамином с 1 - 0,94, лиофилизовали и использовали для очистки k = 0,06 и диаметром набухших гранул 0,05по предлагаемому способу. В качестве ис- 0,07 мм и элюируют со скоростью 9,5 мл/ч. ходного использовали также загрязненный, Отбирают55 мл элюата и фракционируют по окситоцин, представляющий собой узкую 1 мл. Фракции, содержащие целевое веще1747456

Стандартный цикл очистки f 8-аргинин)вазопрессина или окситоцина ство, объединяют и лиофилизуют. Получа-. ют 57,3 мг (91 по основному веществу) (8-аргинин)вазопрессина, индивидуального по ТСХ в системах 1-4.

Пример 2. Очистка окситоцина.

Раствор 109 мг окситоцина в 1 мл 0,2 н.уксусной кислоты наносят на колонку

1,6х43.5 см с сополимером 1-винил-2-пирролидона с N,N -диметакроилгексаметилен1 диамином с I - 0,94, k = 0,06 и диаметром набухших гранул 0,05-0,07 мм и элюируют со скоростью 6 мл/ч. Собирают 40 мл элюатэ, фракционируют по 1 мл. Фракции, содержащие целевое вещество, объединяют и лиофилизуют . Получают 33,3 мг (64 $) по основному веществу) окситоцина, индивидуального по ТСХ в системах 5 и 6.

Пример 3. Очистка загрязненного окситоцина.

Желтоватый раствор 103 мг окситоцина с биологической активностью 99 МЕ/мг наносят на колонку 1,6х28,5 см с сополимером

1-винил-2-пирролидона с N,N -диметакроl илгексаметилендиамином с I - 0,92, k - 0,08 и диаметром набухших гранул 0,1-0,125 мм и элюируют аналогично примеру 2. Получают 10.4 мг (51 по основному веществу) окситоцина.

Пример 4. Получение сополимера

1-винил-2-пирролидона c N,N -диметакро-! илгексаметилендиамином.

8 1,5 л деминерализованной воды растворяют 115 г хлорида натрия при 95ОС и перемешивании, добавляют суспензию 40 r крахмала в 100 мл деминерализованной воды, кипятят в течение 5 — 10 мин, охлаждают до 40 С и растворяют в реакционной среде

180 г карбоната калия. При перемешивании

s течение 3-5 мин добавляют раствор мономеров, состоящий из 150 мг винил-2-пирролидона и

N,N -диметакроилгексаметилен-.

I диамина (21,7гдля k-0,06 и29,6 гдля k- О,08) 150 мл циклогексанола vi 1,5 r азобис-изобу,иронитрила . Реакционную массу пе-". ремешивают при 55"С 20 мин и повышают температуру до 70 С в течение 2 ч. Сополимеризацию продолжают 3 ч, завершая ее

5 при 80 С. Реакционную массу охлаждают и разбавляют 5 л деминерализованной воды.

Полученные гранулы несколько раз промывают этанолом или пропанолом и фракционируют на ситах с различными размерами

10 ячеек. Получают фракции сополимера 1-ви-. нил-2-пирролидона с N,N -диметакроилгек1 саметилендиамином с I 0,94 и k -0,06 или

f - 0,92 и k = 0,08 и диаметром набухших гранул от 0,05 до 0,315 мм с общим выходом

15 81ф>. Удельный объем гранул в воде 5,8-6,2 мг/л. Фракции с диаметром набухших гранул 0,05-0,125 используют для очистки.

Формула изобретения

Способ очистки синтетических (8-арги20 нин)вазопрессина или окситоцина гельфильтрацией на колонке при элюировании раствором уксусной кислоты,отл ичающ-. и и с я тем, что с целью упрощения процесса, в качестве носителя используют сополи25 мер 1-винил-2-пирролидона с

N,N -диметакроилгексаметилендиамином

I формулы

30 СН2-СН 1 СН2-С1 К с=о

NH !

35 @ 2)6

NH

С-0

40 -н,с-c--- Н3 где t - 0,92-0,94; k - 0,06 — 0,08, с диаметром набухших гранул 50-125 мк.

Таблица1

1747456

Таблица 2

Характеристика исходных и очив1енних продуктов

»»»

»

Чистота по ОЭХХ, 2

Нсх . Очиц.. -Apииер

Горнон

6нологическвл актив» " носта, НЕ/иг

Нсх. О ввц.

0 реглаиента исх

Очиц

О ниц

1 (8-Аргнннн)»

° аэопрессин 77/1 84- 1гв1 -1у&1

0,72 (Осн)

0,63 (Нчн) 0,72 68 . 98 324

0,03 (След)

0,35 (Осн)

0,31 (Нин) 0,35 46 230

0,42 (След)

О ° 35 (Осн) 0 35 (Осн)

О,Ь2 (Нии)

101/1»87 -4421 -461 0,31 (Нин) 0,31 (Ннн) 1Ь 71 99

0,17 (След) 0,42 (След)

«и» «» и

1а чистоту (&-аргиннн) вавопрессина исследовали в системе н-пропанол - вода - 252-ний акинак 6: lt3, окснтоцин н-бутанол - уксуснал кислота « вода 4:1>5 (верхилл еаза), проявление хлор-толндиноеин реактивон (&»дргинюн)вавопрвсснн - вавопрвссорное действие, окснтоцин - действие на гладку» нускулатуру натки криви

476 г

2 Окситоцнн 45/2-80 -44т+1 -2621

485 (по 000Х) 97

3 То це

250

- ° систене

Составитель В.Волкова

Редактор Л.Пчолинская Техред M.Ìîðãåíòàë

Корректор П.Гереши

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2471 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5