Конъюгат аденилил(2 @ -5 @ ) аденилил-(2 @ -5 @ ) аденозина с бычьим сывороточным альбумином, используемый для получения антител, специфичных к 2 @ , 5 @ - олигоаденилатам

 

Изобретение относится к биохимии, конкретно к конъюгату аденилил(21-51)аденилил (21-51) аденозина с бычьим сывороточным альбумином. Цель изобретения - повышение стабильности. Конъюгат получают взаимодействием адёнилил (21-51) аденилил (21-51)-21, 31-0-(2-карбоксиэтил/этилиденаденозина с бычьим сывороточным альбумином в присутствии М-этил-М1-диэтиламинопропилкарбодиими - да в среде водной уксусной кислоты или натрийацетатного буфера. Полученный конъюгат стабилен в водных растворах и может быть использован для получения антител, специфичных к 2 ,5 -олигоаденилатам. Ё VJ GJ ел со о VI

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 Illö <

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ гггг ю ж

"| :, /УЗНАЯ

I i".. ":: ." . Ь " = . * ,!фг,, г1 11 1т . 11 ": ф 1,,1 1 /1- 1 „г;г/г| 1

1 (21) 4845719/13 (22) 02.07.90 (46) 23.05.92. Бюл. N. 19 (71) Институт биоорганической химии АН

БССР (72) Т. И. Кулак, Е. И. Квасюк, И. А, Михайлопуло, С. M. Шуляковская, А. Г. Прядко и Т. В. Карпова (53) 615.371/372(088.8) (56) Kerr I. М., Brown R. Е., рррА2"р51

А2 р5"А, an inhibitor of.protein synthesis

synthesied with еп ензугпе fraction from

interfегоttreated cells //Proc, Natl. Acad. Sci.

USA. 1970, ч. 75, NO1, р. 256 — 260.

Kimehi A., Shere Н., Revel М. Regulation

of lymphocyte mitogenesis by (12 — 5) digo—

isoadenylate //Nature (London). 1979, V, 282, .

М 5741, р. 849 — 851.

Knight М. Wreschner D, H„Silverman R.

Н., Kerr I. М, Radioinmune and Radiobinding

Assays for А2 р5 А2 р5 А, рррА2 р5 А2 р5 А, «пб Related

OlIgonucleotides //Methods in Engymol.

1981, V. 79, р. 216 — 227.

Са|Иа Н., Laurence L„Le Borgne, De

Kaouel С., Roux D., Marti>. Мопос!опа!

antibodies to 2 — 5А oligonecleotides:theri use

in radioimmunoassay and Related Proc, Med.

Proc. lnt. Symp. Vienna 21-25 June. 1985, Vienna, 1982, р. 33 — 44.

Carter М. С., Meyerhoff М. Е. Instability

of Succinyl Ebters Linkages in 02—

Monosuccinyl Cyclic AMP — Protein

Conjngates at Neutral рН //J. Imrnunol.

Methods. 1985, V. 81, М 2, р, 245-247.

Kvasyuk Е. I., Kulak Т. I., Laitseva G. V., Miklailopulo I. А., Charubala R., Pfleiderer W.

Synthesis of modidied 2 5-adenylate th

trimer with а 2,3 -di-0-(2-carboxyethyl)1 1

etylidene terminal group //Tetrahedron Lett, 1984, V. 25, % 34, р. 3683-3686.

Чард Т. Радиоиммунологические методы. М.: Мир, 1981, с. 248.

„,. Ж,, 1735307 А1

N-этил-N -диэтиламинопропилкарбодиими—

1 да в среде водной уксусной кислоты или натрийацетатного буфера. Полученный конъюгат стабилен в водных растворах и может быть использован вля получения антител, специфичных к 2,5 -олигоаденилатам.

1735307

Изобретение относится к биохимии, конкретно к конъюгату формулы 1:

04(1е

ННо

=1- Н

Ade=H )!

Ю 0-Р-О I

0 Айе о

НО 0-Р-0

0 О)!4е

0О

НоС СоНч-0-NH-фф

ЬСА-Ъычнй сыеоровочный ильбумин, который может быть использован для получения антител, специфичных к 2,5-олиго1 1 аденилатам.

21,5-0лигоаденилаты — природные низкомолекуля рные биорегуляторы, которые я вляются медиаторами противовирусного действия интерферона (1). Эти соединения присутствуют в различных органах и тканях и обладают широким спектром биологической активности (2), Концентрация 2,5-оли1 I гоаденилатов в клетках зависит от гормонального статуса организма и уровня циклических нуклеотидов. Это свидетельст-.

1 вует о воэможности использования 2,5олигоаденилатов в качестве лекарственных препаратов, а также для создания на их основе средств микроанализа для диагностики различных заболеваний (вирусные, аллергические, аутоиммунные и т.д.).

Широкое распространение для определения природных соединений в биологических объектах получили методы, основанные на использовании антител, специфичных к этим соединениям. 2,5-0лиго1 1 аденилаты сами по себе не обладают иммуногенностью, поэтому для получения иммунного ответа у животных они могут быть использованы для иммунизации в виде конъюгатов с белками. Так как в общем пуле

2,5-олигоаденилатов в клетке основная доля приходится на тример, то естественно, что конъюгаты должны быть получены на его основе.

Известен коньюгат аденилил(2-5)аденилил(2-5)аденозина с БСА формулы:

I но-, Н0 0-P-0 Я1

НО 0-Р-О

О О ) он xï-O в котором связь тримера с белком осуществляется путем периодатного окисления, 2,3-цис-диольного фрагмента 2-термиI нального аденозина с последующими конденсацией образующегося диальдегида с аминогруппами белка и восстановлением

Шиффовых оснований (3), Такой способ получения в данном случае приводит практически к разрушению одного звена в молекуле антигена, что не может не сказаться на специфичности вырабатываемых животным антител.

Более близким по сути к предлагаемому является конъюгат формулы;

10

20 но ""

НΠΠ— Р-О

О ORB

О a O О

®он-l -он,-со,-о -о о -о-со,-о к -о -6I-Е

Полученный путем конденсации 0-сукцинильного производного аденилил-(2 -5)адеI н азин а с Б СА (4). Существен н ы м недостатком такого конъюгата является на25 личие в молекуле лабильной сложноэфирной связи между молекулой димера и

30 остатком янтарной кислоты. Как было показано !!ля конъюгатов 2-0-сукцината аденоI зин-3,5-циклофосфата с белком, гидролиз

1 сложноэфирной связи и разрушение конъюгата происходит в водных растворах даже

35 при — 20 С (5).

Целью изобретения является новый конъюгат аденилил(2 -5)аденил ил(2 -5р2,3l 1 1 I I

0-(2-карбоксиэтил)этилиденаденозина и

БСА, более стабильный в сравнении с опи40 санными в литературе.

Поставленная цель достигается конъюгатом 1, который получают взаимодействием. аденилил(2 — 5)аденилил (2—

I 1 1

5!) — 21,31-0-(2-карбоксиэтил)этилиденаденозина

45 (6) с БСА в присутствии N-атил-N-диэтилаI минопропилкарбодиимида в среде уксусной кислоты или натрийацетатного буфера с последующим выделением и очисткой конъюгата известными способами.

50 Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

К раствору 10 мг БСА в 1 мл воды

55 добавляют10мг(0,007ммоль)аденилил(215 ) аденилил (2"-.5 ) -2,3 -0-(2- карбоксиэтил) этилиденаденозина три (триэтиламмониевой) соли и 7 мг (0,036 ммоль) N-атил-N -диэтиламинопропилкарбодиимида гидрохло1735307 рида. К полученному раствору добавляют по каплям 1 М раствор уксусной кислоты до рН

4,5 и выдерживают смесь в течение 20 ч при комнатной температуре. Раствор диализуют при 0 — 5ОС против воды (Зх500 мл) и хроматографируют на колонке с сефадексом

G-10 (200 смз). Продукт элюируют водой.

Фракции, содержащие конъюгат, собирают и лиофилизуют. Получают 10 мг конъюгата, УФ-спектр в воде: Я к 260 нм.

Степень посадки антигена на белок в полученном конъюгате, определенная спектрофотометрически, составляет 5 моль тримера на 1 моль белка.

Пример 2.

К раствору 30 мг БСА в 3 мл 0,1 M натрийацетатного буфера с рН 4,7 добавляют 44 мг (0,033 ммоль) аденилил(2!-5)аденилил(2!-5)2 -3 -0-(2-карбоксиэтил)этилиденаденозина ! I три(триэтиламмониевой сопи) и 30 мг (0,11 ммоль) N-этил-N -диэтилвминопропилкар-! бодиимида гидрохлорида. Реакционную смесь выдерживают в течение 20 ч при комнатной температуре. диализуют при 0 — 5ОС против 0,01 М натрий-фосфатного буфера с рН 7 35, содержащего 0,15 M NaCI (4 х 500 мл) и хроматографируют на колонке с сефадексом G — 10 (300 см ). Продукт элюируют водой. Фракции, содержащие конъюгат, собирают и лиофилизуют, Получают 32 мг конъюгата, УФ-спектр в Hz0: Q>«260 нм.

Степень посадки антигена на белок в полученном конъюгате, определенная спектрофотометрически, составляет 8 моль тримера на 1 моль белка.

Конъюгат получают с высоким выходом (практически количественный) и хорошей степенью посадки антигена (5 — 8 моль тримера на 1 моль белка), что обусловлено стабильностью соединения как в процессе синтеза так и в процессе выделения, протекающих в водных растворах. Синтезированный конъюгат используют для получения антител, специфичных к 2,5-олигоаденила-! там, что подтверждается следующим примером, Пример 3.

Пять кроликов (случайной породы, массой 2,3 — 2,5 кг) иммунизируют введением 0 5 мл эмульсии 0,25 мг конъюгата 1 в полном адъюванте Фрейнда подкожно в 4-5 точек на спине 7 раз с интервалом в 14 дн. Спустя

1,5 мес. после последней инъекции проводят 5 поддерживающих инъекций с интервалом в 14 дн. и через 10 дн. проводят забор

М Н1

Лйе где АбЕ = !..

-P — 0

На О-P — О

Q Ade аа н с.".с,н„-с-кн-Е

НО

45 где

50 используемый для получения антител, специфичных к 2,5 олигоаденилатам.

55 крови. Антисыворотку выделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин, разбавляют 1:100 0,05 М ацетат-цитратным буфером рН 6,2-6,3 и хранят малыми аликвотами при -20 С, 5 Высокоспецифичная антисыворотка к аденилил (2-5)аденилил(2-5)аденозину была ! I I получена от двух животных через 3 мес, Характеристика антисыворотки.

Путем последовательных разведений

10 установлено, что 50 -ное связывание радиоактивно меченного лиганда достигается при разведении 1:6000, Константа ассоциации, определенная путем построения графика Скэтчарда(7), составляет1;18х10 М ";

15 Кроссреактивность антисыворотки к аденозину, аденозин-5-монофосфату, аденозинI 5!-трифосфату <0,01 u аденилил(3-5!)аденилил(3 -5!)аденозину составляет 0,02%.

20 Конъюгат, не содержащий s своей структуре лабильных сложноэфирных связей, получают и выделяют с количественным выходом. Достигаемая степень посадки гаптена на белок обеспечивает необходимую

25 иммуногенность для получения антител, специфичных к 2,5-олигоаденилатам. КолI нъюгат стабилен в водных растворах и может быть использован для иммунизации без дополнительной очистки после длительного

30 хранения.

Формула изобретения

Ко нъ ю гат аде н ил ил(2 -5 )аденилил-! (2-5)аденозина с бычьим сывороточным

I альбумином формулы: