Способ отбора клеток-доноров ядер у низших позвоночных

 

Использование: селекция и выведение новых пород рыб, исследования по сохранению и реализации генетической информации редких и исчезающих видов низших позвоночных, фундаментальные и прикладные экспериментально-эмбриологические исследования. Сущность изобретения: зародыши костистых рыб на различных стадиях эмбриогенеза освобождают от оболочек, диссоциируют на отдельные клетки в бескальциевом физиологическом растворе для холоднокровных животных, после чего проводят визуальную идентификацию и отбор клеток-доноров ядер по стадиям митотического цикла.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (sx)s С

А 01 К 61/00, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ о

О

CO ()»

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4908699/13 (22) 14.12.90 (46) 15.09,92. Бюл. N 34 (71) МГУ им. M.Â.Ëoìoíocoâa (72) Л.А,Слепцова и Д,В.Попов (56) Ellinger MS. The cell cycle and

transplantation of blastula nuclei in Во(пЬеа

orientalis//Develop. Biol., 1978, ч, 65, р. 81 — 89, Bегоndingen С,Н. The developmental

potential of synchronized amphibian cell

nuclei//Develop. Biol, 1981, ч. 81, р. 115 — 126. Gurdon J,В „Laskey R.À., Reeves ОЯ, The

developmental capasity of nuclei transplanted

from keratinized skin cells of adult frongs//J.

Embryol. ехр. Morph, 1975, ч. 34, р. 93 — 112.

Костомарова А.А. Вьюн.//Объекты биологии развития. М,:Наука, 1975, с, 308 — 323.

Хунг Н,М„Газарян К.Г. Пересадка соматических ядер в активированные яйца костистых рыб (на примере вьюна Misgurnus

fossilis L,).// Онтогенез, 1978, т,9, ¹ 1, с.

85 — 90.

Изобретение относится к способам генной инженерии и разведения рыб, культивирования или сохранения тканей и живых клеток и может быть применено в селекции и выведении новых пород рыб, в практике исследований по сохранению и реализации генетической информации редких и исчезающих видов низших позвоночных, а также в фундаментальных и прикладных экспериментально-эмбриологических исследованиях, имеющих в своей основе метод трансплантации ядер зародышевых и соматических клеток в яйцеклетки, Известен способ отбора клеток-доноров ядер у низших позвоночных, предусматривающий ведение клеточных культур (54) СПОСОБ ОТБОРА КЛЕТОК- ДОНОРОВ

ЯДЕР У НИЗШИХ ПОЗВОНОЧНЫХ (57) Использование: селекция и выведение новых пород рыб, исследования по сохранению и реализации генетической информации редких и исчезающих видов низших позвоночных, фундаментальные и прикладные экспериментально-эмбриологические исследования. Сущность изобретения: зародыши костистых рыб на различных стадиях эмбриогенеза освобождают от оболочек, диссоциируют на отдельные клетки в бескальциевом физиологическом растворе для холоднокровных животных, после чего проводят визуальную идентификацию и отбор клеток-доноров ядер по стадиям митотического цикла. эмбриональных или дифференцированных соматических клеток и синхронизацию их по стадиям митотического цикла.

За прототип может быть выбран способ отбора клеток-доноров ядер у низших позвоночных, который заключается в том, что берут клетки эмбрионов амфибий и выводят их в монослойную клеточную культуру.

Целью предлагаемого способа является упрощение способа отбора клеток-доноров ядер и, повышение точности и надежности метода за счет использования зародышей костистых рыб, а также проведения визуальной идентификации и отбора клеток по стадиям митотического цикла.

1761798

Результаты экспериментов по трансплантации ядер, находящихся на различных стадиях митотического цикла, в неоплодотворенные яйцеклетки вьюна

*) Дробление в 1007ь случаев

**) Развития нет

Поставленная цель достигается тем, что зародышей костистых рыб на различных стадиях эмбриогенеза освобождают от оболочек известным микрохирургическим методом, диссоциируют на отдельные клетки в бескальциевом физиологическом растворе для холоднокровных животных, после чего проводят визуальную идентификацию и отбор клеток-доноров по стадиям митотического цикла.

Использование зародышей костистых позволяет сразу после диссоциации зародыша на отдельные клетки производить визуальную идентификацию и отбор клеток-доноров ядер непосредственно перед опытом под контролем светооптических приборов. Это существенно упрощает способ.

Визуальный отбор позволяет использовать клетки на единственно возможных для опыта стадиях цикла, что повышает точность метода. Отказ от предварительного вывода клеток в культуру предохраняет от появления в опыте различных аномалий.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

Пример 1, Зародышей вьюна освобождают от оболочек двумя остро заточенными препаравальными иглами и диссоциируют на отдельные клетки в.бескальциевом физиологическом растворе для холоднокровных в течение 10 минут при комнатной температуре. После этого предметное стекло с каплей раствора, в которой находятся клетки, помещают в поле зрения бинокулярного микроскопа с общим увеличением 16х — 32х и отбирают клетки с округлым тонко оконтуренным ядром на стадии поздней интерфазы клеточного цикла, после чего ядра трансплантируют в неопло5 дотворенные искусственно активированные водой яйцеклетки вьюна по соответствующей методике (5). Дробление яйцеклеток-реципиентов происходит в

100 случаев (см. табл, 1).

10 Пример 2. Опыт проводят по схеме, как в примере 1, но диссоциацию клеток ведут в течение 20 мин и отбирают клетки, в которых ядра имеют более четко прорисованный утолщенный контур. соответствую15 щий стадии профазы клеточного цикла, и трансплантируют их в яйцеклетки-реципиенты по той же методике (5), Дробление яйцеклеток-реципиентов происходит в

1007ь случаев (см. табл, 1).

20 Формула изобретен ия

Способ отбора клеток-доноров ядер у низших позвоночных, включающий использование зародыша низших позвоночных, обработку клеток бескальциевым раствором

25 для диссоциации с последующим определением стадии митотического цикла, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью упрощения способа, повышения его трчности и надежности, в качестве зародыша низших позвоноч30 ных используют зародыши костистых рыб, а определение диссоциированных клеток на стадиях поздней интерфазы и профазы митотического цикла с последующим отбором осуществляют визуально под контролем

35 светооптических систем,