Штамм гибридных культивируемых клеток mus мusсulus l., используемый для получения моноклональных антител к трансферрину человека

 

Использование: биотехнология и медицина , выделение и очистка трзнсферрина человека. Сущность изобретения: получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к трансферрину человека , не дающие перекрестных реакций с близкородственными белками. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мыши линии Balb/c с клетками мышиной миеломы Sp EBR-5. МКА относятся к lgG1, их титр в культуральной жидкости составляет 1:10 , в асцитной - 1:107. МКА не связываются с гемоглобином, альбумином и С-реактивным белком человека.

СО!ОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4854936/.13 (22) 26.07.90 (46) 07.09.92. 6юл. г в 33 (71) Институт цитологии АН СССР (72) Е.В: Березкина, 3.В. Ковалева, И.Г. Синаке- вич, Е.Э. Завадская, B.À. Плескач и Т.Н. Игнатова (56) 1.Bartek et al., РоНа blologlca, 1984, 30, р.137 — 140.

2.МШег I. et al., Hybridoma, 1988, ч,7, М

1, р.87-95. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК MUS MUSCUIUS L., ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ

МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ТРАНСФЕРРИНУ ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для изготовления иммуносорбента с целью выделения и очистки трансферрина человека.

Известны штаммы гибридных клеток, продуцирующие моноклональные антитела (МКА) к трансферрину человека(1,2). Однако в указанных работах рассматриваются лишь свойства самих МКА и не дается описания каких-либо признаков гибридом, продуцирующих эти MKA. Кроме того, не содержится сведений о взаимодействии MKA с близкородственными и сопутствующими белками (альбумином, гемоглобином и С-реактивным белком) в тканях и биологических жидкостях, Целью изобретения является получение нового штамма культивируемых гибридных клеток мыши, продуцирующего МКА, которые выявляют трансферрин в биологических жидкостях и тканях человека, «. ЯХ, l759872 А1 (я)5 С 12 N 5/00, С 12 Р 21/08 (57) Использование: биотехнология и медицина, выделение и очистка трансферрина человека. Сущность изобретения; получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к трансферрину человека, не дающие перекрестных реакций с близкородственными белками. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мыши линии Balb/с с клетками мышиной миеломы

Sp EBB-5, МКА относятся к Ig61, их тито в культуральной жидкости составляет 1:10, в асцитной — 1:10 . MKA не связываются с

7 гемоглобином. альбумином и С-реактивным белком человека.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии Balb/с иммунизируют подкожно 50 мкг трансферрина человека, растворенного в 0.01 М Na-фосфатном буфере с 0,14 M NaCI, рН 7,2 (ФБС) мульгированного в полном адъюванте Фрейнда в объеме

1:1 (по 0,5 мл на мышь). На 21 и 42 день иммунизацию повторяют и через 21 день после последней иммунизации проводят бустирование, вводя внутривенно (в хвостовую вену) 100 мкг трансферрина человека, растворенного в ФБС (по 0,5 мл раствора на мышь). Бустирование повторяю- в последующие два дня и через один день после последнего проводят слияние клеток следующим образом.

К осадку клеток при постоянном встряхивании пробирки по кэплял добавляют раствор полизтиленгликоля — I Ñ00 {50ь ростовой среды Игла в модифик;цн1,1 Дульбеко (0М ЕМ) с 1 0% диметилсул ьфолс11,",а (AS 0) 1759872

1 мл в течение 1,5 MMH). Затем пастеровской пособность клеток после размораживания— пипеткой в течение 5 мин по каплям и при 70 g,. постоянном встряхивании добавляют среду Прививка культивируемых гибридных

DMEM без сыворотки 10 мл. Смесь клеток клеток штамма 452Д сингенным мышам (лицентрифугируют (1500 об/мин, 5 мин), оса- 5 ния 8alb/с, 10 .клеток на мышь) вызывает у ок ресуспендируют в среде DMEM с сыво- них образование асцитной опухоли. Клетки роткои. успен и . С спензию клеток раскапывают в прививаются со 100/-ной эффективностью

4 лунки 96-ячеечных плат с макрофагами (10 ), и эксплантируются на опухоли в культуру, В внесенными туда накануне. Концентрация асцитной жидкости содержатся МКА к клеток миеломы в микроплатах составляет 10 трансферрину.

10 клеток на лунку, спленоцитов — 10 кле- Продуктивность штамма. При стандартток в 100 мкл среды, Платы помещают в ных условиях культивирования штамма

СО2-инкубатор (6% С02, 37 С). После 24-ча- 452Д 1п vitro титр антител в среде, кондицибации вкаждуюлункумикроплат онированной клетками гибридомы (супер:1 . Тит МКА в с клетками (общий обьем среды в лунке 150 15 натанте), составляет 1: 0 . итр в мкл:50мкл среды с макрофагами и 100 мкл асцитной жидкости, определенный с посреды с миеломными клетками и спленоци- мощью Е, составляет 10 . тами) добавляют по 50 мкл 4-кратной среды МКА, продуцируемые клетками штамма

ГАТ с бромистым зтидием в концентрации 1 52Д в культуральную среду, специфически мкг/мл, Среда ГАТ включает, мкг/мл: гипо- 20 связываются с трансферрином человека, ксантин 136; аминоптерин 0,18 и тимидин что показано с помощью стандартного им3,78. "Кормление" клеток осуществляют пу- муноферментного анализа, а также методом тем замены половины среды в лунках. иммуноблотинга. Продуцируемые MKA не

В результате скрининга полученных связываются с гемоглабином, альбумином и гибридов по признаку продукции антител к 25 С-реактивным белком человека, При проветрансферрину, последующего их клониро- дении радиальной иммунодиффузии в агавания и реклонирования отбирают штамм, розе МКА к трансферрину не образует стабильно продуцирующий МКА к транс- линий преципитации. фе рину, Штамм хранится в Специализироф р С помощью стандартных специфичеванной коллекции клеточных культур 30 ских антисывороток установлено, что МКА, Института цитологии АН СССР под номе- продуцируемые штаммом 452Д, относятся к ром 452Д и характеризуется следующими изотипу IgG1. признаками. П р и мер 1.Для получения MKA. клетки

Штамм культивируется на ростовой сре- штамма культивируют во флаконах Корреля де Игла в модификации Дульбеко (ОМЕМ) с 35 емкостью 100 мл на среде OMEM с добавледобавлением 10/ сыворотки эмбриона ко- нием 10 эмбриональной сыворотки короровы, а также 1 мМ заменимых аминокис- вы, 1 мМ заменимых аминокислот, 1 MM

loT, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глутамина, пирувата натрия, 2 MM глутамина, 5 х 10 М

5 х 10 мМ 2-меркаптоэтанола и 40 ед,/мл меркаптоэтанола и 40 ед./мл гентамицина

40 при 37 С и 5 — 7 Д СО2.

Клетки культивируютпри 37 С винкуба- Посевная доза 1,5 х 10 клеток/мл. Петоре в атмосфере 5 — 77 СО2 или в гермети- ресев проводят через каждые 2 дня с поческих флаконах в термостате без подачи мощью пипетирования. При пересеве

СО2. Способ культивирования — суспензи- клетки штамма стерильно отделяют центрионный. При росте на указанной среде 45 фугированием (3000 об/мин, 5 мин) и исштаммобразуетокруглые клетки. Времяуд- пользуют для дальнейшего культививоения популяции — 36ч. Кратность рассева рования, а среду, кондиционированную

1.2 при пересеве через 48 ч. Посевная доза клетками штамма (супернатант), стерильно

150 тыс. клеток е.1 мл, максимальная плот- сливают. Таким образом проводят 20 пассаность популяции 800 тыс. клеток в 1 мл. 50 жей.

Клонирование клеток приводят в 96-ячееч- С помощью стандартного иммуноферных платах без добавления фидерных кле- ментного анализа (ELISA) устанавливают, ток, При посеве 3 — 4 клеток в лунку чтосупернатантсодержитМКАктрансферзффективность составляет 707.. Способ- ринучеловека. Для этого ктрансферрину(3 ность к продукции МКАсохраняется на.про- 55 мкг/мл в 0,2 М бикарбонатном буфере, рН тяжении 20 пассажей в культуре клеток. 9,5), аорбированному в лунках платы для

Криоконсервацию проводят в эмбрио- иммунологических исследований (по 50 мкл нальной сыворотке коровы с добавлением в каждой)добавляютпромытыйдистиллиро10 $ диметилсульфоксида (DMSO) при кон- ванной водой и фосфатным буфером (0,01 М центрации 1 х 10 клеток в 1 мл, Иммунос- фосфатный буфер с 0,14 М NaCi и 0,05/

1759872

20 электродном буфере; 25 МТрис,,192 М гли25 церин, 20 (1:1) метанол, рН 8,3 в течение 1,5 ч. Качество переноса оценивают путем

35

50

Твин-20, рН 7,2) (ФБР) супернатант в разведении 10 — 10 и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. Затем промывают . водой и ФБР и добавляют в каждую лунку по 50 мкл конъюгата кроличьих антимышиных антител с пероксидазой хрена в разведении 1:500. Через 1 ч платы промывают водой и Ф БР и добавляют по 50 мкл субстрата (0,1 ортофенилдиамин,,0,03 HzO<, 0,2

М цитратный буфер, рН 4,5) в каждую лунку.

По окончании ферментативной реакции расщепления HzO< в присутствии арто-фенилендиамина при наличии МКА развивается желтая окраска, которую регистрируют на спектрофотометре Мультискан при длине волны 450 нм. Связывание МКА с трансферрином человека обнаруживают при разведении супернатанта до 10

Отсутствие взаимодействия полученных МКА с гемоглобином, альбумином и Среактивным белком человека определяют следующим образом. В часть лунок 96-луночной платы наносят по 50 мкл каждого используемого антигена (трансферрина, альбумина, гемоглобина и С-реактивного белка человека) в концентрации 3 мкг/мл карбонатного буфера (0,2 M йа2СОз, 0,2 М

МаНСОз, рН 9,5) и инкубируют 1 ч при 37ОС, .

Затем платы промывают следующим образом; ополаскивают дистиллированной водой, закапывают по 200 мкл ФБС (0,1 М

Na-фосфатный буфер, 0,14 M NaCt, рН 7,2) с добавлением 0,05% Твин-20 (ФБР), выдерживают 3 мин и еще раз ополаскивают дистиллированной водой. В последующем все промывания осуществляют подобным образом. После промывания во все лунки наносят среду, кондиционированную гибридными клетками по 50 мкл на лунку и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. Далее платы промывают вышеописачным способом и наносят антимышиные иммуноглобулины кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена и разведенные 1:100 в

ФБС, инкубируют 1 ч при комнатной темпе- 4 ратуре, промывают и вносят в лунки по 50 мкл раствора субстрата (10 мкг О-фенилендиамин, 10 мл 0,1 Мцитратный буфер,,рН

4,5, 4 мкл 30 Н ОО) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. В случае положительной реакции наблюдается желтое окрашивание лунок. Измерение зкстинции индивидуальных ячеек проводят при 450 нм с помощью автоматического прибора.

Результаты измерений приведены в таблице.

Результаты, приведенные в таблице, свидетельствуют о том, что полученные МКА специфически взаимодействуют с трансферрином и не связываются гемоглобином, альбумином и С-реактивным белком человека.

Пример 2. Готовят пробы для иммуноблоттинга. Белки (трансферрин, альбумин, гемоглобин и С-реактивный белок человека) помещают в буфер для п роб (0,125

М Трис-HCI, рН 6,8, 2% додецилсульфат натрия, 10% глицерин) и нагревают 30 мин при

56 С. Затем подвергают электрофорезу в

12%-ном полиакриламидном геле по методу

Лаэммли (напряжение 40 В, 4 ч). Затем одну часть геля фиксируют в смеси изопропанол (25 ), уксусная кислота (10%). вода остальное в течение 3 ч, окрашивают в том же растворе с добавлением 0,1% амидо черного 10 В и осветляют в фиксирующем растворе.

Другую часть геля используют для проведения электрофоретического переноса белков из геля на нитроцеллюлозный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Перенос белка на нитроцеллюлозу проводят при токе

500 мА в приборе для электроблоттинга в окрашивания геля, использованного для электропереноса белков. В данных условиях наблюдается практически полный перенос белков. После электропереноса проводят иммунологическое выявление белков на нитроцеллюлозе. Для этого электрофоретические блоты ополаскивают раствором ФБС и вымачивают в растворе ФБС с добавлением 0,3% Твина-20 (ФБСТ) 1 ч при 37 С. Блоты разрезают пополам, Одну часть используют в качестве контроля- неспецифического связывания антимышиных иммуноглобулинов кролика, конъюгированных с пероксидазой хрена, и инкубируют с культуральной средой DMEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки. Другую часть блота инкубируют со средой, кондиционированной гибридными клетками без разведения. Инкубацию проводят 18 ч при 4 С.

После инкубации обе части блота промывают раствором ФБСТ четыре раза по 5 мин и инкубируют с антимышинымииммуноглобулинами кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена в разведении 1:1000 в

ФБСТ 1 ч при комнатной температуре, промывают ФБСТ4 раза по 5 мин, 1 ч в ФБС и добавляют субстрат (20 мг диаминобензидин, 0,6 мл 0,1 М имидазол, 10 мкг 30

Н20о. 19,4 мл ФБС, рН 7,2). Инкубируют 20 мин, -Реакцию останавливают, промывая блоты дистиллированной водой, Гели и блоты фотографируют.на пленку "Микрат-300".

На пленке наблюдается только одна полоса

1759872

С-реакти белок ч ин

Il a век

0,041 Щ,01

П р и м е ч а н и в. В скобках указано число измеренных лунок. связывания МКА, соответствующая трансферрину человека. При этом в контроле неспецифическое "прилипание" вторых антител отсутствует. Таким образом, полученные MKA специфически узнают трансферрин человека.

Пример 3, Синтез трансферрина— одна из многих тканеспецифических функций печени. При различных заболеваниях печени в диагностических целях представляет интерес охарактеризовать временную и пространственную организацию данной функции в ткани печени, оценить долю клеток, синтезирующих трансферрин, которые могут меняться в ходе развития поражения органа, Подобный подход позволяет выявить нарушение функции и прослеживать динамику функционального состояния гепатоцитов и печени в целом. MKA по сравнению с традиционными цитохимическими методами позволяют с высокой чувстви-. тельностью и точностью выявить индивидуальные антигены и, в частности, трансферрин в ткани печени, и таким образом открыть возможности в дифференциальной диагностике заболеваний печени, Трансферрин выявляют в ткани печени следующим образом, Кусочки печени от двух. человек (относительная норма и хронический гепатит), полученные путем прижизненной пункционной биопсии, фиксируют в 4% формалине, на 0,1

М ффооссффааттнноом м ббууффееррее, рН 7,4 в течение 2 ч, промывают в том же буфере, обезвоживают в спиртах восходящей концентрации, проводят через хлороформ и заливают в парафин, Приготавливают срезы толщиной 5 мкм. Перед иммуногистохимическим анализом проводят депарафинирование в 2 сменах ксилола (по 3 мин) и регидратируют в нисходящих по крепости спиртах (по 3 мин в каждом). Промывают в ФБС. Для подавления собственной пероксидазной активности срезы после 100 спирта (перед 96 спиртом) инкубируют в метаноле с 0,3%

HgO< в течение 30 мин..

После промывки в ФБС срезы инкубируют в ФБС с добавлением 0,1% санонина

1 ч, ополаскивают в ФБС и и кубируют с

ЯКА без разведения 30 мин. В качестве кон5 троля неспецлфического связывания вторых антител срезы параллельно инкубируют без первых антител с ФБС.

После промывания в ФБС (3 раза по 5 мин) срезы инкубируют с вторыми антитела10 ми — антимышиными имглуноглоб„:::инами кролика, конь агиронанны ли с пероксидазой хрена в разведении 1;100 в ФБС в течение 30 мин. После промывания -. ФБС (4 раза по 5 мин) инкубируют с субстрато.л (1

15 мг диаминобензидина (ДАБ1. 2 r n Трио-НС1, рН 7,5 4 мкл 30% Н200} 10 мин в темноте.

Далее пром IBB от в ФБС (3 раза по 5 мин) и усиливают реакци;о с, по.лощь .о О. 1 ; ОзОл в течение 2 мин, "ате 1 со ",раз про..лываroT в

20 ФБС,3 раза но !.= . и.:, об- ож .:;-;:.гот л спиртах вссходягцей . », "нтр-. ци:"; (по 3 раза в каждотл), осветляюг в 2 сменах ксилола (по 3 мин) и заклrî ают в;анадский бальзам.

Срезы фотографиру:от ..а приборе "Морфок25 вант", объектив х 25. пленка (у1икрат-300".

Результаты исследований г;оказывают, что не наблюдается неспешлфического связывания контрольн»х антит=.ri, огда как при обработке срезов практи,ески все гепа30 тациты в разной степени выраженности, особенно при поражении пе ени, содержат трансферрин, т.е. наблюдается резкая гетерогенность гепатоц IT08 по со»ерманию трансферринз по сравнению с относитель35 ной нормой, Таким образом, полученные МКА специфически выявляют трансферрин человека в биологических жидкостях и тканях человека и могут быть использованы В,диагностиче40 ских целях.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемь1х клеток MUs ITlUscUIUs L., 1 452Д, используемый

45 для получения моноклональных антител K трансферрину человека.