Штамм гибридных культивируемых клеток mus мusсulus l, используемый для получения моноклональных антител к общей антигенной детерминанте альфа-1-антитрипсина человека и обезьян

 

Использование: биотехнология, медико-биологические и приматологические исследования. Сущность изобретения: получение штамма гибридных культивируемых клеток Mus musculus L, продуцируемого моноклонального антитела (МКА) к общей антигенной детерминанте альфа- 1-антитрипсина человека и обезьян. Штамм получают гибридизацией сленоцитоз мышей линии Balb/C, иммунизированных очищенным альфа-1-антитрипсином человека, с клетками миеломы мыши Х63- Ад8,653. Концентрация МКА в культуральной жидкости состаляет 5 мкг/мл, в асцитной - 5 мг/мл. Продукция МКА стабильна по крайней мере в течение 20 пассажей . Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИС i ИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю С 12 N5/00, С 12 P 21/08

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4865393/13 (22) 13.09.90 (46) 23.08.92. Бюл. ¹ 31 (71) Научно-исследовательский институт экспериментальной патологии и терапии

AMH СССР (72) Е.И, Самильчук, Ж,Ш. Сарсания, М.Л.

Хаджирисьян и И.Г. Зоделава (56) Wallmark А., Aim R., Eriksson S. Monoclan

antibody specific for the mutant PlZ а1—

antiirypsln and Its аррИcation in an ELlSA

procedure for identification of PiZ gene сагг!ез. Proc. Natl, Acad, Sci:, 1984, ч. 81, р.

5690-5693.

Zxu Х-J., Chan S.Ê. Phe use of

monoclonal antibodies to distinguish, several

chemically modified forms of human a>protelnase inhibitor. Biochem; l., 1987, ч. 246, р. 19-23. (54) llITAMM ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК MUS MUSCULUS L, ИСПОЛЬ-

Изобретение относится к биотехнологии v может быть использовано в медикобиологических и и риматологических исследованиях, Известны моноклональные антитела (МКА) к ААТ, однако все они направлены к

ААТ человека. Так они получили аллелеспецифичные моноклональные антитела к ААТ ,человека, т.е. направленные к антигенной дете р мина нте, и рис утст вую щей на ААТ, контролируемом аллелем Z (аллель Z — редкий генетический вариант, встречающийся только у человека).

Наиболее близким к изобретению является гибридный штамм, продуцирующий

МКА к нативному ААТ человека. Проводи,,5U„, 1756352 Al

ЗУЕМЫХ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ОБЩЕЙ АНТИГЕН НОЙ ДЕТЕРМИНАНТЕ АЛЬФА-1-АНТИТРИПСИНА

ЧЕЛОВЕКА И ОБЕЗЬЯН (57) Использование: биотехнология, медико-биологические и приматологические исследования. Сущность изобретения: получение штамма гибридных культивируемых клеток Mus глвзси1оз L., продуцируемого моноклонального антитела (МКА) к общей антигенной детерминанте альфа1-антитрипсина человека и обезьян, Штамм получают гибридизацией сленоцитов мышей линии Ва1Ь/С, иммунизированных очищенным альфа-1-антитрипсином человека, с клетками миеломы мыши Х63 Ag8,653. Концентрация MKA в культуральной жидкости состаляет 5 мкгlмл, в асцитной — 5 мг/мл. Продукция МКА стабильна по крайней мере в течение 20 пассажей. (Я ли иммунизацию мышей очищенным препа- Q ратом ААТ человека(нативным, окисленным и в комплексе с трипсином). Кроме МКА, ц реагирующих с нативным МКА человека, получили и МКА, реагирующие только с окисленной формой человеческого ААТ, а также МКА, специфичиие к комплексу ААТ- ) и трипсин. ° ииай

Взаимодействие перечисленных моноклональиых антител с ААТ обезьян неизвестно.

Цель изобретения — получение штамма гибридных клеток, продуцирующего моноклональные антитела к антигенной детерминанте ААТ, общей для человека и обезьян.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BALB/c иммунизируют очищенным ААТ человека по следующей схеме; 100 мкг ААТ в полном адьюванте

Фрейнда в/мышечно в две задние лапы; через 28 дней 4 ежедневных введения (в/брюшинно, В/Бенно) по 100 мкг ААТ в забуференном фосфатами физиологическом растворе (ЗФР). На следующий день после последней иммунизации проводят слияние, процедура которого включает следующие этапы.

Спленоциты, полученные путем гомогенезирования селезенки в среде 199, помещают в центрифужную пробирку и отстаивают в вертикальном положении в течение 10 мин, затем 9/10 суспензии переносят в пластиковую центрифужную пробирку, заполняют ее до 40 мл средой 199, однократно отмывают в среде 199 и суспекдируют в среде RPMI 1640 (10 кл/мл).

Паралельно миеломные клетки (линия

Х63-А9.8,653) трижды отмывают средой

199 и также суспендируют в среде RPM1

1640 в той же концентрации, Спленоциты (10 клеток) и миеломные клетки (2 . 10 ) сме7 шивают B пластиковой центрифужной пробирке, заполняют средой RPM1 1640, тщательно суспендируют и центрифугируют при 800 об/мин B течение 10 мин, Супернатант удаляют практически насухо, осадок разрыхляют постукиванием пальцем о дно пробирки и по каплям в течение 1 мин добавляют к клеточному осадку 50%-ный раствор полиэтиленгликоля 6000. Нижнюю часть пробирки опускают в водяную баню (370C) на 1,5 мин, постоянно встряхивая ее вращательными движениями. Слияние останавливают разбавлением средой RPMI

1640 — в течение первых 30 с вносят 1 мл среды, в следующие 30 с — еще 3 мл среды и затем в течение 1 мин — около 15 мл среды, Далее пробирку заполняют средой до 40 мл, суспензию инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре и центрифугируют при 800 об/мин в течение

10 мин. Осадок осторожно ресуспендируют в среде RPMI 1640 с 15% телячьей эмбриональной сыворотки и ГАТ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин) до концентрации 5 10 кл/мл (без учета потерь при слиянии). За 24 ч до слияния в 96-луночные плоскодонные панели для клеточных культур засевают перитонеальные клетки нормальных мышей BALB/с ("перитонеальная кормуш ка").

Для получения последних мишам в/6 вводят 0,34 М раствор сахарозы, брюшко массируют, животных забивают и отбира5

1от раствор с клетками, среди которых не менее 50% составляют мэкрофаги. После отмывания s среде 199 клетки суспендируют в среде RHMI 1640 с 15% телячьей эмбриональной сыворотки + ГAT и рассеивают в лунки (150 мкл, 5000 клеток на лунку). Немедленно после завершения слияния в каждую лунку вносят около 2,5 10 клеток

5 смешанной суспензии. Панели с микрокупьтурами иккубируют при 37 С в атмосфере с содержанием 5 — 7% СО . Клетки просматривают под инвертированным микроскопом ежедневно, начиная с 5-х суток после слияния. С этого же момента через день в каж- дой лунке меняют приблизительно

flopñÁ 1Hу средьь

Культивирование гибридных клеток в присутствии ГАТ проводят в те ение первых двух недель после слияния, затем еще 4 дня клетки культивируют в присутствии ГТ (без аминоптерика) и далее переводят на обычную среду без добавок. Отбор гибридсм, продуцирующих MKA требуемой специфичности, осуществляют с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). В первом случае на твердой фазе адсорбируют ААТ человека, во втором — AAT павиака гамадрила. Для реакции используют 96-луночные ИФА панели, в лунки которых вносят ААТ (2 мкг/мл, 100 мип Н3 лунку), разведенный в 50 мМ карбонатном буфере, рН 9,5, Адсорбци о ведут при 4 t в течение

16-18 ч, после чего панели,рижды отмывают ЗФР, содержащим 0,05% Твина 20 (ЗФР-Тв), Затем в лунки вносят исследуемые купьтуральные жидкости в разведении

1;5 (100 мкп на лунку) и инкубируют в течение 1 ч при 37 С, Пластины трижды отмывао ют 3ФР-TB и в каждую лунку вносят 100 мкл коньюгата — эктисыворотку к иммуноглобулинам мыши, меченную пероксидазой (1;1000 в 3ФР-Тв с 1% обезжиренного сухого молока). Используют KQMMGp åñêèé коньюгат, адсорбированный иммукоглобулинами человека и ряда животных, Инкубацию с коньюгатом проводят при 37 С в течение 1 ч.

После 5 отмываний 3ФР-Тв в лукки вносят по 100 мкл раствора субстрата-ортофенилендиамина/HzOz (р Н 6,0).

Инкубацию с субстратом осуществляют в темноте при 37 С, обычно в пределах

10 — 30 мин (обеспечивая максимальную разницу между положительным и отрицательным контролями). Реакцию останавливают 1М серной кислотой (25 мкл на лунку), Результаты учитывают на спектрофотометре при длине волны 492 нм. В каждую постановку включают контроли; положительный, отрицательный и контроль коньюгата. Гибридому, продуцирующую MKA

17с 63г;2 нужной специфичности, клонируют в лунках

96-луночных панелей, содержащих "перетониальну а кормушку". Плотность рассева при клонировании — 1 клетка на 3 лунки.

Полученный штам л обозначают .как

AAT-ЕС1, он депонирован во Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером

В ССК(П) 464Д и характеризуется следующими признаками, Культуральные свойства, Способ культивирования — в стеклянных или пластиковых флаконах на 50 -250 мп, посевная доза

500 тыс, клеток в 1 мл, кратность рассева—

1:2, время субкультивирования 3-4 дня.

Культивирование в среде RPMi 1640 с 15% телячьей эмбриональной сыворотки при

37 С в атмосфере с содержанием 5% СО .

Культивирование гибридомы в организме животного, Мыши BALB/c обработаны пристаном (1 мл в/б за 10 дней до инокуляции), Доза инокуляции 5 — 10 млн клеток, время образования асцита 10-20 дней, Характеристика полезного продукта.

Уоноклональные антитела относятся к

lgGL, специфически реагируют с общей антигенной детерминантой ААТ человека и обезьян, Специфичность оценивают иммуноферментным методом с использованием в качестве антигена очищенного препарата

ААТ человека, а также имглунобпоттингам после изоэлектрофокусировгния в полиакриламидном геле (рН 4-5) сывороток крови различных видов приматов с использованием в качестве контроля коммерческой монаспецифической антисыворотки к этому бел ку.

Продуктивность штамма, Концентрация моноклональчых антител в культуральной среде около 5 мкгlмл, в асцитной жидкости около 5 мг/мл. Титры данных антител 10 (в среде) и 10 (асцит) при концентрации антигена 2 мкг/мл. Продукция моноклональных антител стабильна, по крайней мере, в течение 20 пассажей in vitro, Контроль контаминации бактериями, грибами, микоплазмами и вирусами нет, Способ криоконсервирования 5 — 6 млн клеток в телячьей эмбриональной сыворотке+ 10% ДУСО, программное замораживание в жидком азоте. Жизнеспособность после размораживания составляет 70% (аценка жизнеспо-.îáíîñòè по включению трипанового синего).

Пример. Известно, что каждый род (а в ряде случаев и вид) обезьян характеризуется своим собственны л вариантом (или

55 варианта ли) АTT. Эти варианты вкпючэ1от мажорные и минорные полосы. расположенные в строго определенных участках геля при осуществлении изоэлектрафакусирования, Сведения о полиморфизме ААТ у приматов позволяют изучать реактивность полученных MVA c AAT большого числа родов и видов обезьян, Процедура исследования включает изоэлектрофокусирование в полиакриламиднам геле, белковый перенос и иммунопроявление с помощью MKA. Изоэлектрофокусирование проводят в попиакриламидном геле в градиенте рН 4-5 или

4 — 6,5 в течение 4 ч (включая 1 ч префокусиравания) при напряжении 2000 В и температуре охлаждения 4 С. Сыворотки человека и обезьян с известными вариантами ААТ наносят на бумажные аппликаторы (1:5 в

НзО, 20 мкл), которые помещают на гель на расстоянии 1 см от катода. После окончания изоэпектрофокусирования методам контактной диффузии осуществляют перенос белка с геля на нитроцеллюпозную: мембрану, Для предотвращения неспецифической адсорбции мембрану выдерживают 1 ч при комнатной температуре в растворе 8%-ного сухого обез:киренного молока и после отмывки ЗЮРIТв инкубируют с МКА (в разведении 1 .4 для культуральной жидкости и

1:500 для асцита), После трех отмываний

ЗФР/Тв мембрану инкубируют с антимышиным пеаоксидазным коньюгатом в разьедении 1;250 в ЗЭР/Тв+1%-нае сухое молоко. После тщательного отмывания мембрану помещают в раствор субстрата (диаминобензидин/Нг02) и инкубируют в темноте при 37 С, Результаты свидетельствуют о том, что полученные MKA взаимодействуют с "древней" консервативной детерминантной ААТ приматов, сохранившейся в процессе эволюции этого отряда.

Последнее определяет равную эффективность MAT как в отношении разных родов и видов приматов, так и в отношении разных аллельных вариантов внутри одного рода.

Полученные MKA могут быть испо ьзованы B медицинских исследованиях для моделирования заболеваний человека и в научной работе, Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток Мьз musculus L ВСКК/П) N 464 0, используемый для получения маноклональных антител к общей антигенной дете р ми н анте an ьфа-1-антитрипсина человека и обезьян.