Штамм бактерий bacillus alvei - продуцент рестриктазы bav в ii

 

Использование: биотехнология и в молекулярно-генетических работах и генноинженерных исследованиях. Сущность изобретения: биомассу В alvei BKM В-674 выращивают в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода , азота и минеральные соли до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса штамма бактерий В.alvei BKM В-674 содержит новую эндонуклеазу рестрикции Bav В II, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК 5 ... G CNCC ... 3 , в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах: содержание рестриктазы Bav BII в биомассе 3-4 х 10 ед/г сырой микробной массы. Для рестриктазы Asu I, изошизомера эндонуклеазы рестрикции Bav BII, содержание фермента в биомассе и выход очищенного препарата фермента не указаны. Выход очищенного препарата рестриктазы Bav BII составляет 8-12 х 103ед на 1 г сырой биомассы. Рестриктазы Bav BII не содержит примесей фосфатаз, неспецифических эндонуклеаз и экзонуклеаз. V fe

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st)s С 12 N 9/16, 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ.К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4896775/13 (22) 27.12.90 (46) 15.09.92, Бюл, ¹ 34 (71) Институт биологической и медицинской химии AMH СССР (72) Н.Н.Соколов, Н.B.Àíèêåé÷åâà, А.Б.Фицнер, О.Т.Самко, Э,Б.Хорошутина, А.А.Калугин и Г,И.Либрик (56) Roberts R.j., Nucl, Acids Res., 1989, ч.16, pr 271 — r 313

Hughes S.G., Bruce Т., Murray К., Biochemical J., 1980 ч. 185, р, 59 — 63, Авторское свидетельство СССР

N 1170777, кл. С 21 N 9/14, 1983. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS ALVEI—

ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ BAV B II (57) Использование: биотехнология и в молекулярно-генетических работах и генноинженерных исследованиях. Сущность изобретения: биомассу В alvei BKM В-674 выращивают в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углеИзобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в молекулярно-генетических работах и генноинженерных исследованиях.

Рестриктазы II класса(синонимы: эндонуклеазы рестрикции, сайт-специфические эндонуклеазы), осуществляющие расщепление фосфодиэфирных связей ДНК по специфическим нуклеотидным последовательностям (сайтам), являются незаменимым инструментом исследования в практике молекулярно-генетических и. генно-инженерных работ, представляют собой уникальный объект для изучения природы и механизмов белково-нуклеиновых взаимодействий. Этими обстоятельствами и объясняется огромный интерес

„„. Ы„„1761803 А1 рода, азота и минеральные соли до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса штамма бактерий В.alvei ВКМ В-674 содержит новую эндонуклеазу рестрикции Вач В II, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК 5 ... G CNCC „, 3, в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах: содержание рестриктазы Bav Bll в биомассе 3 — 4 х 10 ед/г сырой микробной массы. Для рестриктазы Asu I, изошизомера эндонуклеазы рестрикции Вач Bll, содержание фермента в биомассе и выход очищенного препарата фермента не указаны.

Выход очищенного препарата рестриктазы

Вач BII составляет 8 — 12 х 10 ед на 1 г сырой

3 биомассы. Рестриктазы Bav Bll не содержит примесей фосфатаз, неспецифических эндонуклеаз и экзонуклеаз. исследователей в области биохимии, молекулярной биологии, микробиологии, вирусологии к выявлению продуцентов новых рестриктаз, разработке способов их очистки, изучению свойств, использованию в молекулярно-генетических экспериментах, Рестриктазы выделены и частично или полностью охарактеризованы из более чем

1100 микроорганизмов самых различных таксонов /1/, Одна из рестриктаз, Asul, выделена из штамма АпаЬаепа subcylindrica

CCAP 1403/4В /2/, Эндонуклеаза рестрикции Asul расщепляет ДНК фага А в 74 участках, ДНК аденовируса Ad 2 в 164, ДНК обезьяннего вируса

SV 40 в II, ДНК фага Х174 в 2 и плазмиду

1761803

pBR322 в 15, Фермент гидролизует участок нуклеотидной последовательности ДНК 5 ... G GNCC ... 3 .

Содержание рестриктазы Asul в биомассе АпаЬаепа subcyllndrica ССАР

1403/4В и выход очищенного от примесей неспецифических нуклеаз фермента не приводятся, Целью изобретения является получение штамма бактерий, продуцирующих с высоким выходом новую рестриктазу Вач Bll, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5 ... G CNCC ... 3, Поставленная задача достигается тем, что биомассу B,alvei ВКМ В-674 выращивают в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами, Рестриктаза Bav B ll, изошизомер Asul, узнает и гидролизует участок нуклеотидной последовательности ДНК 5 „, G GNCC ...

3 . Эндонуклеаза рестрикции Bav Bll расщепляет ДНК фага А по 74 участкам, ДНК аденовируса Ad2 по 164, ДНК обезьяннего вируса SV40 по 11, ДНК фагафХ174 по 2 и плазмиду pBR322 по 15, Поиск штамма-продуцента проводили с использованием экспресс-метода определения сайт-специфической энедонуклеазной активности в толуольных лизатах микробных клеток с последующим электрофоретическим разделением в агарозном геле продуктов расщепления ДНК фага А.

Всего обследовано 18 штаммов Bacillus

a lvei.

Штамм В.alvei BKM В-674 получен из

Всесоюзной коллекции микроорганизмов

AH СССР, где хранится под N ВКМ В-674

NCI В8199 NRRL В-384

Характеристика штамма

Морфологические особенности. Палочковидные клетки, прямые или почти прямые, размером 0,5--0,8 х 2 — 5 мкм, подвижные (признак варьирует). Расположены поодиночке и парами, образуют споры. Грамположительны (при+ знак непостоянный, варьирует Гр - Гр).

Культурально-биохимические свойства

На скошенном агаре — слабый, нежный налет, Колонии на МПА очень мелкие, блестящие, выпуклые с ровными краями, На мясо-пептонном бульоне и бульоне

Хоттин гера — заметное равномерное помутнение, сероватая нежная пленка.

Отношение к кислороду — аэроб.

Каталаза — образует.

Утилизация углеводов — на глюкозе, лактозе, сахарозе образуют кислоту; на арабинозе, ксилозе и манните кислоту не образуют, Крахмал — гидрол изуют.

Лакмусовое молоко — свертывание, пептонизация.

Индол и диоксиацетон — образуют, Казеин — расщепляют, Тирозин — не расщепляют, Фенилаланин — не дезаминируют.

Оптимальные условия выращивания и хранения культуры, Культура В.alvei ВКМ В-674 хорошо растет на жидких и твердых полноценных питательных средах — бульоне Хоттингера, среде

LB,ìÿñoïåïòîííîì бульоне, Максимальная и минимальная температура роста культуры соответственно 35 — 45

С и 15 — 20 С, а оптимальная температура—

37 С. Оптимум роста рН 7,0 — 7 — 2, При рН

10 культ,ра не растет.

Наибольший выход биомассы, содержащей рестриктазу Bav Bll, получают в том случае, когда штамм-продуцент выращивают при 37 С в аэробных условиях в ферментере на питательной среде Хоттингера, которая содержит в 1 л: 250 мл основного перевара Хоттингера; 10 г NaCI; 1 г К НРО4;

Н20 до 1 л, Выращивание прекращают через 3 — 4 в конце логарифмической фазы роста, когда рост достигает Аеас=1,3 — 1,5.

Выход биомассы 6,5 — 8,5 г/л. На среде "рыбный экстракт" (на основе гидролизата кильки) культура растет медленно, а накопление активности рестриктазы в 3 — 4 раза ниже, чем при культивировании на средах LB или

Хоттин гера.

Ферментацию культуры проводят после добавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему среды.

Рабочие культуры пересевают на мясопептонный бульон или бульон Хоттингера один раз в 7 — 10 дней.

Хранят культуру в полужидком мясопептонном агаре под вазелиновым маслом в лиофилизированном виде в ампулах, Культура непатогенна для мышей.

Выделение рестриктазы Bav Bll проводят фракционированием бесклеточных экстрактов изопропанолом и хроматографией на ионообменнике и аффинном сорбенте, Инкубационная смесь для определения активности рестриктазы Bav Bll, обьемом

30 — 50 мкл, содержит: 0 01 M трис-HCI буфер, рН 7,5, 0,01 M MgClz, 0,001 М дитиотреитола (или 0,007 М 2-меркаптоэтанола), 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 1 мкг ДНК фага Л и 0,1 — 1,0 мкл фермента. Инкубацию проводят при 37 С в

1761803

Составитель И.Привалова

Редактор В.Трубченко Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Л.Ливринц

Заказ 3235 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород. ул.Гагарина, 101 течение 60 мин. Продукты расщепления

ДНК фагал анализируют электрофоретически в 0,8 — 1% агарозном геле с последующим прокрашиванием геля в бромистом этидии, 3а единицу активности рестриктазы 5

Вач Bll принимают количество фермента (в мкл), которое за 1 ч инкубации полностью гидролизует 1 мкг ДНК фага при оптимальных условиях реакции.

Пример 1. Культура В.alvei В KM В-674 10 предварительно адаптируют на основной питательной среде, содержащей в 1 л; 250 мл перевара Хоттингера; 10 г NaCI; 1 r

К2НРО4; ДО 1 л ВОДЫ.

Инокулят для ферментера готовят, пе- 15 ресевая адаптированную культуру на 1 л свежей среды из расчета 1:10 и размножают в условиях аэрации.

Выращивание культуры проводят после добавления в ферментер инокулята в соот- 20 ношении 1:10 к объему при температуре 37

С в аэробных условиях (1 л воздуха на 1 л питательной среды), рН среды 7,0, Во время выращивания рН культуральной жидкости поддерживают в интервале рН 7,2 — 7,5. 25

Выращивание продолжают до достижения конца логарифмической фазы роста, Выход сырой биомассы составляет 6,5—

8,5 г/л культуральной жидкости.

Содержание рестриктазы Bav Bll — 4 х 30

10 ед/г биомассы.

Выделение рестриктазы Bav Bll

10 г биомассы Bacillus alvei BKM В-674 суспендируют в буферном растворе и клетки разрушают ультразвуком при +2 — 4 С. 35

Остатки клеточных оболочек и неразрушенные клетки удаляют ультрацентрифугированием, а бесклеточный экстракт фракционируют изопропанолом. Обогащенный рестриктазой материал хроматографируют в калий-фосфатном буфере в градиенте KCI на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой 0Е-52, а затем на колонке с голубой сефарозой С(=6В.

Получают 12 х 10 ед активности ре4 стриктазы Bavli в 10 мл буфера с 50 . глицерином, Выход очищенного препарата фермента 12 х 10 ед активности на 1 г сырого веса биомассы, Препарат рестриктазы Вач Bll стабилен при хранении втечение

8-10 месяцев при температуре — 20 С.

Препарат фермента не содержит примесей фосфатаз, неспецифических эндонуклеаз и экзонуклеаз и пригоден для структурных исследований ДНК и генно-инженерных работ, Пример 2. Культивирование штамма

Bacillus alvei ВКМ В-674 проводят аналогично описанному в примсре 1 за искл ючением того, что в качестве питательнои среды используют среду LB, ка-орая содержит в 1 л:

10 г триптона; 5 г дрожжевого экстракта; 5 г

NaCI; до 1 л воды.

Выход биомассы 6-7 г/л культуральной жидкости.

Содержание ре" i риктазы Bav Bil 3 х 104 ед/г микробной массы.

После проведения очистки, как описано выше, выход рестриктазы Bav Bll составляет 8 х 10 ед активности/г сырого веса биомассы, Таким образом, по предложенному способу получают новую Оестриктазу.

Формула изобретния

Штамм бактерий Bacillus alvei BKI В674 — продуцент рестриктазы Bav B I I.