Штамм бактерий вrаdyrнizовiuм sp. (vigna) для получения бактериального удобрения под @ маш

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, вчастности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур. Целью изобретения является создание штамма Bradyrhlzpblum sp. для получения бактериального удобрения под маш. Штамм бактерий Bradyrhizoblum sp. (VIgna) выделен из клубеньков маша, депонирован во ВНИИСХМ Мг 1901. Штамм позволяет увеличить урожай зерна маша на 3,4 ц/га или на 33,3% по сравнению с контролем. Штамм улучшает качество зерна за счет повышения в нем белка на 2,8%. 4 табл.•слс

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4744542/13 (22) 29.09,89 . (46) 15.02.92. Бюл. N. 6 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии (72) А.Т.Новикова, В.Л.Князева, А.П.Кожемяков, Н.M,Ëàçàðåâa и Н.Г.Орищенко (53) 631.847.211(088,8) (56) Кожемяков А.П., Афанасьева Л.M.; Новикова А.Т. Бюлл, ВНИИСХМ, 1985, М 40, с. 25-30. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BRADYRHIZOBIUM

SP. (VIGNA) ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО УДОБРЕНИЯ ПОД МАШ

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур

Известен штамм Rhlzoblurn phaseoII

696, который используют для инокуляцйи фасоли обыкновенной. Однако штамм 696 не может быть использован в качества микросимбионта маша, так как он не вступает в активный симбиоз с этой культурой:

Целью изобретения является создание штамма Bradyrhlzobium sp. для получения бактериального удобрения под маш.

Клубеньковые бактерии шт. 1901 выделены из клубеньков маша.

Штамм определен по определителе берги,, „„ЯЛ„, 1712348 А1 (st) s С 05 Е 11/08. C 12 N 1/20 (57) Изобретение относится к сельскохозяйственной микробйологии и биотехнологии, в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур. Целью изобретения является создание штамма Вradyrhizoblum sр. для получения бактериального удобрения под маш. Штамм бактерий Bradyrhtzoblum sp. (Vtgna) выделен из клубеньков маша, депонирован во ВНИИСХМ М 1901. Штамм позволяет увеличить урожай зерна маша на

3,4 ц/га или на 33,37, по сравнению с контролем. Штамм улучшает качество зерна за счет повышения в нем белка на 2,8 .

4 табл.

Шт, Bradyrhtzobium sp, (Vigna) 1901 депонирован в коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под М 1901.

Шт. 1901 растет на питательных средах следующего состава: ЬЭ

1. Гороховый агар, г/л: горох 100,0; са- «Д хароза 20,0; агар 20,0; рН 6,8- 7,0. ф

2. Люпиновый агар, г/л: К2НРО4-0„5; Q()

КН2РО4-0,5; HgS04x7HzG — 0,2; NaCI -0,2;

CaS04 — 0,1; (NH4)zMo04 — следы; маннит—

20,0; люпиновая мука — 10;0; агар - 20,0: pH—

6,8-7,0.

3. Маннитно-дрожжевой агар, г/л: маннит- 10.0; К НРО4 — 0,5; М9$04х7Н20 — 0,2;

NaС1 — 0,1; дрожжевой экстракт — 0,4 агар—

15,,0; рН вЂ” 6,8-7,0, Морфолого-культуральные свойства.

Вегетативные клетки.

На косом маннитно-дрожжевом агаре с .

РН 6,8-7,0 при 26-28 С в пятисуточной

1712348 культуре имеют форму слегка изогнутых палочек с закругленными концами, размер

2,4 — 3,6х0,7 — 0,8 мкм, грамотрицательные, до

72 ч подвижные, затем по мере старения— к 5 суткам — утрачивают подвижность, монотрихи, Медленнорастущая культура.

Образование специализированных клеток.

При старении культуры на люпиновом агаре с рН 6,8-7,0 и при 26-28 С в возрасте

10 сут и более образуются бактероиды ветвистой формы.

Характеристика роста на плотной среде.

1. Люпиновый агар, Т вЂ” 26 — 28 С, рН

6,8-7,0 а) Штрих 5-суточной культуры умеренный, белый, слизистый, слабовыпуклый, блестя щий. б) Колонии появляются на 7-е сутки; на

10-е сутки колонии имеют размер 1-1,5 мм, однотипные, круглые, выпуклые, с ровными краями, слизистые, S-формы, белые.

2. Маннитно-дрожжевой агар, Т -2628 С, рН 6,8 — 7,0 а) Штрих 5-суточной культуры обильный, беловатый, стекающий. б) Колонии появляются на 7-е сутки; на

10-е сутки имеют размер 1-2 мм, однотипные, круглые, выпуклые, с ровными краями, слизистые, $-формы, беловатые.

3. Гороховый агар, Т вЂ” 26-28 С, рН 6,87,0 а) Штрих на гороховом агаре скудный.

Эта среда используется для получения колоний. б) Колонии появляются на 7-е; на

10-å сутки имеют размер 1-1,5 мм, однотипные, круглые, выпуклые, с ровными краями, слизистые, S-формы, белые.

Рост в жидкой среде.

Молоко с пакмусом, Т -26-28 С, не пептонизирует, подщелачивает. После 48 ч окраска молока изменяется в сторону синего спектра, максимальное изменение цвета отмечается на 15-е сутки.

Физиолого-биохимические свойства, Симбионт.

Макросимбионт-бобовое растение маш.

Отношение к: а) кислороду — аэроб; б) Т максимальная 40 минимальная 10 оптимальная 26 — 28 с) рН максимальный 8,0 минимальный 6,0 оптимальный 6,8-7,0

Источники углерода д е

Глюкоза Ащ (-) Галактоза Ащ

Сахароза Ащ

Лактоза Ащ

Маннит Ащ

5 Сорбит Ащ

Рамноза Ащ

Ксилоза Ак

Мальтоза Ащ

Декстрин Ащ

10 . Клетчатка

Крахмал

Жидкая среда Норриса, Т вЂ” 26 — 28 С

Источники азота Ж

ИаЦОз +

15 (NH4)z$04 +

Тирозин " +

МПА

Азот фиксирует в симбиозе с машем.

Другие характерные физиологические

20 особенности обмена.

Желатину не разжижает.

Штамм не патогенен.

Штамм 1901 хранится на люпиновом агаре указанного выше состава, рН 6,8-7 0, 25 при 4 С и пересевается один раз в 6 мес.

Оценку симбиотических свойств штамма 1901:вирулентности, азотфиксирующей активности и эффективности симбиоза проводят в условиях микровегетационных и ве30 гетационных опытов.

Вирулентность определяют по.количеству и морфологии клубеньков, образованных при инокуляции маша клубеньковыми бактериями.

35 Азотфиксирующую активность определяют по величине активности нитрогеназы.

В свою очередь нитрогеназную активность измеряют ацетиленовым методом (по редукции ацетилена) на интактныхклубеньках..

40 Эффективность симбиотический азотфиксации определяют по общему накоплению азота растениями на сосуд, а такжз по величине урожая зеленой массы маша и содержанию в ней азота, который определяют

45 с помощью системы Кьельтек-ауто Текатор (Ш веция).

Пример 1. Микровегетационный опыт.

В большие пробирки с 6 г стерильного вермикулита добавляют 19 мл среды Кра50 сильникова-Кореняко, г/л: К2НР04 — 1,0;

Mg$G

M.В.Федорову — 1 мл (НзВОз — 5.0; (NH4)2Mo04 — 5,0; KJ — 0,5;. NaBr — 0,5;

55 Еп$04х7Н20 — 0,3; А!2($04)зх18Н20 — 0,3;

Мп$04 — 0,2. Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве. Семена маша.стерилизуют 0,57-ным раствором сулемы в течение 1 мин, промывают стерильной водой и раскладывают на увлажненные стерильной во1712348 дой бумажные фильтры в чашках Петри для прорастания. Через двое суток проростки -в асептических условиях раскладывают по одному в пробирки со средой. Опыты ставят в

10-кратной повторности. Клубеньковые.бактерии для инокуляции растений выращивают на косом люпиновом.агаре в пробирках в течение 5 сут при 28 С и суспендируют в растворе микроэлементов. Через 5 сут по1 мл инокулюма, имеющего концентрацию

10" клеток. Растения выращивают в фитотроне при 22-24 С. Через 34 сут корни растений с клубеньками отмывают водо15 проводной водой и отдельно с каждого.растения помещают в реакционный флакон емкостью 50 мл, который закрывают резиновой пробкой, завинчивают пластмассовой крышкой с просверленными отверстиями. Во все флаконы через отвер- .20 стие в. крышке шприцем вводят,5 мл ацетилена. Экспозицию с ацетиленом корней с клубеньками проводят при 26 С. Через 2 ч реакцию останавливают введением 2 мл реактива Несслера. Количество этилена, обра25 зовавшегося в результате восстановления ацетилена нитрогеназой клубеньковых бэктерий, определяют через сутки на газовом хроматографе "Цвет 100". Величину нитро30 геназной активности клубеньков, которая характеризует азотфиксирующую актив.ность штамма, выражают в микромолях

CzH4 за 1 ч на 1 растение.

Результаты представлены в табл.1.

Данные табл.1 показывают, что бактерии штамма 1901 вирулентны на маше: они образуют на его корнях типичные для этого растения клубеньки; бактерии штамма 696 не образуют клубеньки на этом бобовом растении, т.е. они невирулентны на маше.

Штамм 1901 является активным азотфиксирующим микросимбионтом маша: нитрогеназная активность клубеньков, об40 разованных бактериями этого штамма на растении — хозяине, на 3 порядка выше, чем у контрольных растений и растений, инокулированных штаммом 696.

Результаты микровегетационных опытов по определению общего накопления

50 азота растениями маша, бактеризовэнными вышеупомянутыми штаммами, представлены в табл.2.

Как показывают данной этой таблицы, в результате активной фиксации атмосферно-. го азота клубеньковыми бактериями штам- 55 ма 1901 в симбиозе с машем улучшэлэсь обеспеченность растений азотом, благодаря чему общее накопление азота в них было на 374,7% выше, чем при использовании

: штамма 696. При этом урожай зеленой мэасле посева семян в каждую пробирку вносят 10 сы растений, инокулированных штаммом

1901, повысился на 56,64, а содержание азота в ней на 1,46%.

В растениях, инокулированных штаммом 696, симбиотическая фиксация азота атмосферы отсутствовала, растения дополнительно не снабжались азотом из воздуха, в результате продуктивность маша в этих вариантах не увеличивалась.

Приведенные материалы свидетельствуют о том, что an.ивная симбиотическая азотфиксация у маша может быть получена только при инокуляции специфичными для него штаммами клубеньковых бактерий.

Ввиду этого в дальнейшие опыты известный штамм не включался, Пример 2. Вегетационные опыты проводят в сосудах с 6 кг дерновоподзолистой почвы с внесением солей по прописи

Прянишникова, r/êã почвы: KCI — 0,15;

MgS04 — 0,06; CaXP04 — 0,172; MnS04—

0,003; борная кислота — 0,008; (NH4)2 УоОд — 0,001; МН4МОз — 0,024 (0,1 нормы). Повторность опыта 4 кратная. Использовали семена маша сортообразца из Узб.ССР (Коллекция ВИР) с машем.

Для инокуляции семян чистую культуру бактерий выращивают на скошенном люпиновом агаре в течение 5 сут. Культуру в пробирках с титром 4 — 6 млрд. кл смывают водопроводной водой, затем суспензию наносят на семена маша, разложенные в лунки, сделанные в почве каждого сосуда, В сосуд вносят 10 кл. в

Данные влияния инокуляции маша штаммом 1901 íà его продуктивность приведены в табл.3.

Из этой таблицы следует, что штамм

1901 вступает в эффективный симбиоз с машем, усиливает у него процесс симбиотической азотфиксации и благодаря этому свойству способен увеличивать продуктивность растения-хозяина: урожай зеленой массы. повышается на 128,1%, содержание белка в растениях на 11,2%.

Пример 3. Получение препарата иа основе штамма 1901.

Приготовление жидкой посевной культуры, Жидкую культуру выращивают нэ качалке в качалочных колбах и пятилитровых бутылях в течение 3 — 4 суток на среде следующего состава (мас.%): гороховый отвар — 10,0; глюкоза — 0,5; сахар пищевой — 0,5, (NH4)zS04 — 0,05; КН2РО4 0,05;

К2Н РО4хЗН20 — 0,05; Mg SOpx7Hz0 — 0.02;

СаСОз (стерильный) — 0,03; вода водопроводная — остальное. рН после стерилизации

1712348

63-6,6, Среду стерилизуют при 1 атм 30 мин. Титр бактерий 4-5 млрд/мл.

Посевную культуру используют для получения жидкой. рабочей культуры. Ее готовят в пятилитровых бутылях или ферментаторах на среде следующего состава, мас.$: кукурузный экстракт-1,0; пекарские дрожжи (влажные) — 0,05; меласса -1,0; глюкозаа — 0,5; (И На)2304 — 0,1; КН2РО4 — 0,025;

K2HPO

СаСОз — 0,1; вода водопроводная — остальное; рН после стерилизации 6,2-6,5.

Бутыли и ферментаторы засевают посевной культурой клубеньковых бактерий в количестве 5%. Бутылки встряхивают на качалке в течение 72-96 ч. В ферментаторах бактерии выращивают в течение 36-48 ч при ступенчатой аэрации 0,2 — 0,1 об/мин под избыточным давлением 0,3-0,5 атм при 2830 С. Титр не менее 5 млрд/мл. После микробиологического контроля культуральную жидкость иэ бутылей и ферментаторов— инокулюм — используют для смешивания с торфом.

Подготовка торфа.

Размолотый низинный торф, нейтрализованный мелом до рН 6,8 — 7,0 с влажностью

30-407 в полиэтиленовых пакетах по 200400 г, стерилизуют гамма-облучением при дозе 2,5 Мрад. Стерильный торф в пакетах инокулируют иньекцией смеси: Культуральная жидкость+ меласса (3,) из расчета исходного титра бактерий в торфе 0,15-0,8 млрд/г торфа и влажности 45-60%. Затем пакеты загружают в специальные смесители, при вращении которых перемещается их содержимое. Ризоторфин хранят при 1015 C в темном сухом помещении отдельно от ядохимикатов.

Характеристика готового продукта.

Риэоторфин для маша на предлагаемом штамме представляет собой по внешнему виду увлажненную сыпучую массу темного цвета без запаха, нерастворимую в воде.

Влажность готового продукта 50 — 55 g. Ризоторфин содержит 3-4 млрд бактерий в 1 г торфа. Срок годности препарата 6 мес со дня изготовления. Расход препарата 200 r на гектарную норму семян.

Пример 4. Конкретное использование штамма 1901 в полевых условиях.

Эффективность симбиотической азотфиксации штамма 1901 определена в полевом опыте по величине урожая зерна и содержанию в нем белка. Почва опытного участка — орошаемые сероземы, площадь делянки 10 м; повторность опыта 4-кратная.

Вносили минеральные удобрения РооКво.

5 Использовали семена маша. Семена обрабатывали ризоторфином, изготовленным на основе штамма 1901.

Доза препарата 200 г на гектарную норму семян, титр. препарата 3 млрд/г. Способ

10 внесения препарата: 200 r ризоторфина разводят в 1 л водопроводной воды и, не давая суспензии отстаиваться, наносят ее на гектарную норму семян. Затем семена тщательно перемешивают для равномерного

15 распределения препарата. Обработанные ризоторфином семена высевают в тот же день во влажную почву.

Штамм 1901 является видеоспецифичным по отношению к машу, по сравнению с

20 ранее описанным, т.е. известный штамм не вступает в эффективный симбиоз с машем.

Поэтому в полевом опыте было лишь два варианта: контроль, где растения могли инфицироваться природной популяцией ризо25 бий и вариант с инокуляцией штаммом 1901 (табл.4).

Данные табл.4 показывают, что штамм

1901 является высокоэффективным симбиотическим азотфиксатором. Улучшение азот30 ного питания инокулированных растений маша сортообразца из УЗССР (Коллекция

ВИР) за счет более интенсивного поступления биологического азота оказывает положительное влияние как на урожайность

35 растения-хозяина, так и на его качество.

Урожай зерна маша при бактеризации этим штаммом повышается на 3,4 ц/га или на

33,3%. Штамм улучшает качество зерна за счет повышения содержания в нем белка на

40 2,8%.

Таким образом, штамм Bradyrhlzobium

sp. (Vigna) 1901 существенно увеличивает аэотфиксирующую способность маша, пои ы шает его урожай и улучшает качество уро45 >кая эа счет увеличения в нем белка. Это указывает на то, что штамм является активным азотфиксирующим микросимбионтом маша и может быть использован для получения бактериального удобрения.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bradyrhlzobium эр. (Ицпа) ВНИИСХМ 1901 для получения бактериального удобрения под маш.

1712348

Таблица 1

Таблица 2

Эффективность симбиотической аэотфиксации штаммов 1901 и

696.

Табл и ца 3

Эффективность симбиоза штамма 1901 машем.

Вирулентность и азотфиксирующая активность штаммов 1901 и 696.

1712348

Таблица 4

Эффективность штамма в полевом опыте с машем

Составитель С. Левин

Редактор В. Трубченко Техред М.Моргентал

Корректор Л. Патай

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

Заказ 507 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-36, Раушская наб., 4/б