Способ стерилизации субстрата-носителя для культивирования клубеньковых бактерий

 

Использование: сельскохозяйственная микробиология, производство препаратов клубеньковых бактерий, применяемых при возделывании бобовых культур. Цель: снижение себестоимости субстрата. Сущность изобретения: измельченный торф увлажняют, добавляют 10%-й водный раствор янтарной кислоты до содержания 0,004- 0,04% от сухого вещества торфа, выдерживают при комнатной температуре 24 ч, полученный субстрат-носитель расфасовывают в полиэтиленовые пакеты по 50 г, герметично запаивают и стерилизуют ионизирующим излучением в дозе 0,8-1,0 Мрад. Способ позволяет снизить дозу облучения с 1,2 Мрад до 0,8-1,0, что приводит к снижению энергозатрат. 2 табл.

„„59„„1712347 А1

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (s1) s С 05 F 11/08, С 12 N 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Изобретение относится к сельскохозяй- . счет чего снижается титр инокулянта, сокрэственной микробиологии и может быть ис- щаются соки хранения препарата. пользовано в производстве препаратов - Наиболее близким техническим реше- ) клубеньковых бактерий, применяемых при.: нием является способ, в котором в качестве (А) возделывании бобовых культур.. субстрата-носителя используют измельчен- ф „

Известенспособстерилизациисубстра-.-. ный торф, почву и их смеси с добавками та-носителя для клубеньковых бактерий, . источника углеводов, минеральных веществ предусматривающий внесение в субстрат и эктивированного угля, стерилизацию осутакой как торф, почв и их смесь источника ществляют после расфасовки в непроницауглеводов, минеральных веществ и активи- - емую для микроорганизмов упаковку рованного угля, нейтрализацию полученной ионизирующим бета- или гамма-излученисмеси мелом, ее стерилизацию. ем, увлажнение проводят в два этапе — сначала до расфасовки до влажности 25-40%, а затеи после расфасовки до влажности

40-60%.

Недостатком этого способа является отсутствие в субстрате-носителе добавок. снижающих дозу облучения. Кроме того, Недостатком данного способа является отсутствие в субстрате-носителе добавок, интенсифицирующих процесс стерилизации; в составе получаемого препарата имеется много загрязняющей микрофлоры, зе (21) 4722461/13 (22) 23.05.89 (46) 15.02.92. Бюл. N- 6 (71) Всесоюзный научно-исследователь-. ский институт. сельскохозяйственной микробиологии, Белорусский научно-исследовательский институт почвоведения и агрохимии и Институт ядерной энергетики АН БССР (72) В.M.×èêàíoâà, И.В.Черненок, В.А.Барисевич, А.B.Õîòÿíîâè÷, В.М.Васильев и M.À.Кра-: скович (53) 576.8(088,8) (56) Авторское свидетельство СССР И. 592807, кл. С 05 F 11/08, 1976.

Авторское свидетельство СССР

М 922104, кл. С 05 F 11/08, 1982. (54) СПОСОБ СТЕРИЛИЗАЦИИ СУБСТРАТА-НОСИТЕЛЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ (57) Использование: сельскохозяйственная

: микробиология, производство препаратов клубеньковых бактерий, применяемых при возделывании бобовых культур. Цель: сни- жение себестоимости субстрата. Сущность изобретения: измельченный торф увлажняют, добавляют 10%-й водный раствор янтарной кислоты до содержания 0,0040,04% от сухого вещества торфа, выдерживают при комнатной температуре 24 ч, полученный субстрат-носитель рэсфасовывают в полиэтиленовые пакеты по 50 r, герметично запэивают и стерилизуют иони- 3 зирующим излучением в дозе 0,8-1,0 Мрад.

Способ позволяет снизить дозу облучения с

1,2 Мрад до 0,8 — 1,0, что приводит к снижению энергозатрат. 2 табл.

1712347 себестоимость торфяных препаратов в значительной мере (около 307;) определяется затратами, связанными с применением принятых доз (1,2 Мрад) гамма-облучения.

Снижение такой дозы позволяет уменьшить себестоимость продукции.

Цель изобретения — снижение стерилирующей дозы за счет добавки в субстрат сенсибилизатора процесса радиационной стерилизации, Для достижения цели перед облучением в субстрат-носитель дополнительно вводят янтарную кислоту в количестве 0,004-0,04 .

Добавка янтарной кислоты стимулирует жизнедеятельность микроорганизмов, прорастание спор. Так как находящиеся в состоянии

"покоя" микроорганизмы более радиорезистентны, чем в процессе активной жизнедеятельности, этот метод позволяет снизить стерилизующую дозу облучения.

Способ заключается в том, что в субстрат-носитель вводят янтарную кислоту в количестве 0,004-0,04 от массы сухого субстрата-носителя, затем полученную смесь тщательно перемешивают и выдерживают при 20 — 30 С в течение 24 — 36 ч. Далее субстрат-носитель расфасовывают в непроницаемые для микроорганизмов пакеты и подвергают радиационной стерилизации при дозе облучения 0,8 — 1,0 Мрад.

Пример 1. В размолотый торф вводят раствор янтарной кислоты в количестве

0,004 от массы сухого торфа, доводят его влажность до 40 и нейтрализуют мелом.

Параллельно готовят аналогичную смесь, но без янтарной кислоты. Обе смеси выдерживают при комнатной температуре в течение

24 ч с целью активизации процесса жизнедеятельности микроорганизмов.

Полученный субстрат-носитель расфасовывают в полиэтиленовые пакеты по

50 г и герметично их запаивают. Пакеты подвергают облучению ионизирующим излучением, Затем пакеты, содержащие субстрат-носитель с янтарной кислотой, а также пакеты без янтарной кислоты разделяют на две группы: в одной группе определяют степень стерильности субстрата-носителя, а в другой группе в пакеты вводят клубеньковые бактерии, подращивают, определяют их титр и количество загрязняющей микрофлоры.

Степень стерильности определяют следующим образом.

Пакеты сразу же после облучения вскрывают, берут среднюю навеску субстрата-носителя из каждого пакета в количестве 1 r, разводят ее в 100 мл стерильной воды, тщательно размешивают и пипеткой отбирают 1 мл суспензии, Микробиологический посев производят в чашки Петри глубинным способом с использованием агаризованной среды МПА и выдерживают в течение 3 сут в термостате при 28+1 С, после

5 чего производят подсчет выросших колоний.

Для определения титра загрязняющей микрофлоры подсчитанное на чашках Петри количество колоний умножают на 100, поскольку разведение навески субстрата10 носителя было произведено в 100 раэ.

В оставшуюся часть пакетов шприцеванием вводят жидкую культуру клубеньковых бактерий по 25 мл на пакет с титром 10

КБ/г, в результате влажность субстрата-но15 сителя достигает 60 Д, место прокола заклеивают липкой лентой, содержимое пакетов перемешивают, пакеты выдерживают при

20 — 30 С в течение 30 сут для подращивания клубеньковых бактерий. После этого опре20 деляют титр клубеньковых бактерий. Для этого пакеты вскрывают, берут среднюю навеску препарата в количестве 1 г, разводят в стерильной воде, делая последовательно

8 разведений, из последней по разведению

25 колбы отбирают 1 мл суспенэии, высевают в чашки Петри с использованием бобовой среды. Выдержав чашки Петри с посевом клубеньковых бактерий в течение 3 сут при

28+1 С, подсчитывают число колоний и ум30. ножают полученное значение на 10 .

Количество загрязняющей микрофлоры устанавливают таким же образом, как при определении степени стерильности.

Результаты влияния 0,004 ° янтарной

35 кислоты на микрофлору торфа и на содержание КБ в субстрате-носителе после его радиационной стерилизации приведены в табл.1.

Иэ данных табл.1 видно, что введение

40 янтарной кислоты в количестве 0,004 от сухой массы торфа приводит к снижению стерилиэующей дозы с 1,2 до 0,8 Мрад, т,е. на 33 .

Пример 2. В размолотый торф вводят

45 раствор янтарной кислоты в количестве

0,04 от сухой массы торфа, Далее проводят операции по методике примера 1.

Результаты опытов приведены в табл.2.

Опыты показывают; что стерилизующая

50 доза субстрата-носителя беэ янтарной кислоты составляет 1,2 Мрад, а с янтарной кислотой 0,8 Мрад, т.е. за счет введения янтарной кислоты произошло снижение стерилизующей дозы на 33, 55 . Уменьшение в субстрате-носителе содержания янтарной кислоты ниже 0,004 от массы сухого субстрата-носителя приводит к приближению значений стерилизующей дозы к 1,2 Мрад, т.е. эффект действия янтарной кислоты практически не определяется.

1712347

Формула изобретения

Способ стерилизации субстрата-носителя для культивирования клубеньковых бактерий путем обработки торфа гамма-об5 лучением, î t л и ч а ю шийся тем, что, с целью снижения себестоимости субстрата, перед облучением в торф вносят янтарную кислоту в количестве 0,004 — 0,04$ от сухой массы субстрата, полученную смесь выдер10 живают 24 — 36 ч, а обработку гамма-облучением осуществляют в дозе 0,8-1.0 Мрад.

Увеличение содержания янтарной кислоты выше 0,047, вызывает снижение титра клубеньковых бактерий в препарате.

Использование изобретения позволяет снизить время облучения или уменьшить активность источника излучения; что в обоих случаях приводит к уменьшению энергозатрат на радиационную стерилизацию и к уменьшению стоимости субстрата-носителя, Табли а 1

Без янтарной кислоты

Титр иикрооргаиизиов

С янтарной кислотой

Титр никроорганизиов

Пакет

Пакет

Доза, Ирад

КБ

КБ

Иикрофлора торфа

Иикрофлора торфа

Титр, КБ/

<10:

Проба 1

Загрязнению, а от

КБх10

Проба 2

Проба 2

Титр, КБ/г

«10

Проба l

Загрязнения, 2 от

КБх10

0,0 1

Сплошной рост заг язняшщей иикрофлор»

700 700 2;О

400 400 1,8

800 300 2,0

700 400 2,0

800 800 . 2,2

600 400 2,0.

0 О 26.

О О . 2,8

Сплошной рост загрязняющей никрофлоры

0,5

0,23 !!

0,29 .

0,3! 13

0,17 14

О, 10. 15

0,10 1Ь

0,03 17

0,04 18

0,8

1,0

1,2

Таблица 2

Без янтарной кислоты

Пакет

Доза!

Ирад

С янтарной кислотой

Пакет

Титр иикроорганизмов

Титр иикроорганизиов

Иикрофлорв торфа

КБ

КБ

Иикрофлора торфа

Проба 1 Проба 2

Tmp> ЗагрязКБ/ нения, з10 2 от

КБх10 >

Проба 1 Проба 2

Тит-„

КБ/г

>!От

Загряз" нения

8 от >, КБх10 загрязня>ещей

0,0

32 загрязняв0>5 25

0,9 0,20

0,7 0,34

0,6 0,31

0,5 0,10

1,0 О, !2

1,2 0,10

1>8 0,09

2;3 0,05

0,07

3 2 0,006

3,5 0,003

0,5

2,2 О 35

1,8 0,46

1,5 0,59

1,0 0 ° 45 3,4 0,009

3,7 0,01

2,8 0,001

3,8 0,005

3,9 0,007

3,8 0,009

3,8 0,003

3,8 0,008

0,8

О О

0 0

О 0

О 0

1,0

О 100

100 - 100

0 0

0 О

1,2

» г

Составитель Т. Полянская

Редактор Н. Киштулинец Техред>М.Моргентал Корректор H. Ревская

Заказ 507 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб» 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

21

22

23

24

26

27

28

29

Сплошной рост щей микрофлоры

300 200

500 500

200 308

300 400

400 400

200 100

100 100

100 . !00

33

34

36

37

38

39

41

42

43

50 100

О 50

О О

О О

О О

О О

О О, О О

Сплошной рост никрофлоры

100 100

100 50

100 50

100 200

0 О

О О

0 0

0 О

1,4

0,7

2,9

3,2

3.2

3,8

2,9

2,8

0,44

0,41

0,02

0,006

0,06

0,02

0,003

0,007