Способ определения супероксидустраняющей активности

 

Использование: биохимия, биотехнология . Сущность изобретения: генерируют супероксид реакций гидроксиламина в щелочной среде с последующей визуализацией путем взаимодействия с тринитросиним тетразолия. О величине супероксидустраняющей активности судят по разнице оптических плотностей опытной и контрольной проб, 2 табл.

СОГОЭ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

rsIts G 01 N 33/48

ННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ССР

ССР) АНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

du

as

Bi

Изобретение относится к биохимии и мо жет быть использовано для определения супероксидустраняющей (СУА) или суперокси тдусмутаанои (СОД) активности.

Цель изобретения — ускорение и упрощ ние процесса определения СУА.

Способ осуществляют следующим образо ».

В пробирки. помещенные в любое термс1статирующее устройство (t = 30 С) вносят

I необходимый объем (0,1 М) карбонатного буфера, рН = 10,2 с 1 мМ ЭДТА и 24 мкМ

ТАСТ, Затем в опытные пробирки вносят ис1ледуемые образцы в О," М карбонатном буфере с 1 MM ЭДТА, в контрольную (xonoI ст ю) пробу — равный объем буфера. Реакц ю запускают добавлением ги роксиламина до концентрации 1 мМ, одн временно в холостой и опытных пробах.

Через 5 минут после запуска (т.к. эа это время достигается экстинкция 0.2) реакцию останавливают добавлением 0,5 мл 1 М (21 (22 (46 (71 ст (72 цы (5

dI

su

$1 р

АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ ЬСТВУ

4763457/13

28.11.89

07.02.93, Бюл, N. 5

Азовский научно-исследовательский интут рыбного хозяйства

В.А. Чистяков, Г.А. Голубев и А.С. Лиси) К. Hyland, Е. Voisin, С, Supегоxide

mutase assay using alkaline dinutyl

foxide us supегоxide amon gene tatIon on

tern. — Anal Biochem. 1983, ч.135, №2, 80-287, 2. Kono i, Jeneration of supегоxide radical

ing antoxidation of hydroxilamina and ау for supегоxide dismutase. Archives of

chem and Biophys., 1978, ч.186, ¹ 1, 89-195.

„, ЯЛ„„1793375 Al (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУПЕРОКСИДУСТРАНЯЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ (57) Использование: биохимия, биотехнология. Сущность изобретения: генерируют супероксид реакций гидроксиламина в щелочной среде с последующей визуализацией путем взаимодействия с тринитросиним тетразолия. О величине супероксидустраняющей активности судят по разнице оптических плотностей опытной и контрольной проб. 2 табл. трис-HCI буфера, рН 7,4. содержащего 1 g тритона Х-100, После остановки реакции измеряется экстинкция в опытных и холостой пробах. Супероксидустраняющая (супероксиддисмутазная) активность рассчитывается по отношению Еюо контрольной и опытной проб

Е

СУА =

2 Еыо где СУА — супероксидустраняющая активность в единицах;

E5so — Е5бо контрольной пробы;

Е5во — Esto опытной пробы, Пример 1. Исследовали СУА аминокислоты цистина.

Для определения CYA в 19 пробирках, помещенных на водяную баню (ВБ-2) при t

30 С, вносили по 1 мл 0,1 М Na — карбонатного буфера рН = 10,2 с 1 мМ ЭДТА и 22 мкМ

ТИСТ(Буфер А). Затем в пробирки добавили

1793375

Таблица 1

Супероксидустраняющая активность цистина (Расчет по значениям Е560) 540 MIVl раствор цистина в буфере А до необходимой концентрации с учетом последующего разбавления. СУА всех опытных проб и в контроле 1 (холостая проба) определяли в 3-х повторностях. Все пробы доводили до объема 1,8 мл буфером А. Для запуска реакции в пробирки с интервалом 3 с. вводили по 0,2 мл 0,10 мМ раствора гидроксиламина в дистиллированой воде. Через 5 мин реакцию генерации супероксид-аниона останавливали при достижений зкстинкции 0,2 добавлением в каждую пробирку 0,5 мл 1 М трис HCI буфера, рН 7,4 с 17 „тритона X-100. Останавливающий буфер добавляли также с интервалом 3 с для того, чтобы время генерации для всех пробирок было одинаковым, Экстинкцию (Еыо) проб определяли при помощи СФ-26, CYA расчитывали по формуле к

СуА = Е во

2 Е во

В таблице 1 приведены значения Ему для всех 19 проб.

Из табл. I видно, что цистин проявляет

СУА, увеличивающуюся с увеличением его концентрации, Формула изобретения

Способ определения супероксидустраняющей активности, включающий введение анализируемого образца в реакционную смесь, содержащую 0,1 М карбонатный буфер с рН 10,2, тринитросиний тетразолий

1 мМ, ЭДТА 1 мМ и гидроксиламин 1 MM c последующим инкубированием и измерением оптической плотности, по величине котоВремя определения СУА в 19 опытных пробах 10 мин в контроле 2 определение

СУА одной пробы занимает 15 мин (способпрототип).

Данные по CYA цистина приведены в табл, 2, Пример 2, Аналогично примеру 1 исследовали CYA аминокислоты гистидина, Данные приведены в табл.2.

Пример 3. Аналогично примеру 1 исследовали СУА аминокислоты метионина.

Данные приведены в табл.2.

Из табл.2 видно, что все исследованные аминокислоты проявляют СУА, увеличивающуюся с увеличением концентрации аминокислоты.

Данные, полученные при помощи обоих способов, достоверно не отличались.

20 Таким образом, предложенный способ позволяет значительно упростить и ускорить в 3-12 раз определение СУА за счет введения опытного образца до запуска генерации супероксид-аниона и останови генерации субстрата в процессе определения. рои оценивают супероксидустраняющую активность, о тл и ч а ю щи йс я тем, что, с целью ускорения и упрощения процесса, гидроксиламин вводят в реакционную смесь после анализируемого образца, инкубируют реакционную смесь и реакцию останавливают при достижении экстинкции 0,2 добавлением 0.5 объема 1 М трис-Н CI буфера с рН 7,4. содержащего 1 тритона X-100.

1793375! !

Продолжение табл. 1

Таблица 2

СУА аминокислот цистина, гистндина и метианина (усредненные Эначенил) 15

27

18

Аминокислота

KoNll. HM

Метр

Цистин

Гистидин

Метионин

Составитель С. Хализова

Техред М.Моргентал Корректор Н. Король

Ре актор

За аз 502 Тираж Подписное

I

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Контроль 2

Опыт

Контроль 2

Опыт

Опыт

Контроль 2

0.62

«0.03

0.60

0.02

0.49 0.04

0,46

+0.09

0.42

«0.03

0,42

«0.03

0,90

«-0.07

0.89

0.03

0.50

0.05

0.55

+0.10

0.52

«0.02

0.52

+0.02

0.85

«0.05

0.89

+0.0Б

0.60

+ 0.06

0.56

+O.04

0.53

0,04

0,58

+0.05

1.05

0.08

1.04 0.03

0.63

«0,01

0.63 0.02

0.53

0.06

0,51

0.02

1,40

«0.14

1,44

«0,11

0.63

«0,04

0.61

0.04

0.56

«0. 10

0.50.

+0.06

1.32

«0,11

1.35

«0,11

0.70

+0.09

0.72

«0.12

0.67

«0,05

0,70

0.06

1.60

0.06

1.60

«0.07

0.89

Ю.03

0,71

0.09

0.73

+0,02

0,70

«0.09

1.76

«0.10

1,70

+0,12

1,10

0,05

1,12

0,05

0.90

«0,02

0.92 .+0.04

1.91

«0,06 !.94

«0.08

1.20

0.07

1,22

«0,02

0.81

0.03

0.85

0 08