Способ диагностики вирусных болезней животных

 

Использование: ветеринария, вирусология . Сущность изобретения: при диагностике вирусных болезней смешивают антителосодержащую жидкость от подозреваемых в заболеваниях животных с эталонным вирусом. Смесь инкубируют, вносят ее в монослойную культуру клеток. Затем инкубируют инфицированную культуру и учитывают результаты реакции. В качестве антителосодержащей жидкости используют лимфоциты. Способ позволяет идентифицировать возбудитель по ранней стадии заболевания .

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К ПАТЕНТУ (21) 4924525/13 (22) 03.04.91 (46) 23.02.93. Бюл. N 7 (71) Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт (72) В.A,Ìèùåíêî, А.С.Толокнов, Е.В.Новожилова, А. И.Дудников, Т, В.Тюрина, В,И.Шоршнев, Н.В.Мищенко, С.А.Рыбакова и Н.Е.Балакина (73) Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт (56) Сюрин В.Н, и соавт. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных, M., Агропромиздат, 1986, с. 207.

Предполагаемое изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано в диагностике исследованиях при вирусных инфекциях и определении иммунного статуса животных.

Известен ряд способов анализа вирусов (антигенов) иммуноферментным методом (ИФ М).

Этот метод позволяет за 16-24 часов определять вирусспецифические белки при их концентрации не менее 1-10, нанограммов.

Существенным недостатком ИФМ, как и других иммунохимических методов, является то, что они позволяют определять лишь вирусы, которые по антигенной структуре соответствуют производственному штамму, Этого недостатка лишена реакция нейтрализации(РН), в основе которой заложено то, что в случае отличий вирус не нейтрализуется вирусспецифическими антителами и размножается в чувствительной системе, „„5U„„1797709 АЗ (ял G 01 и 33/53, А 61 К 39/12 (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ

БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ (57) Использование: ветеринария, вирусология, Сущность изобретения; при диагностике вирусных болезней смешивают антителосодержащую жидкость от подозреваемых в заболеваниях животных с эталонным вирусом. Смесь инкубируют, вносят ее в монослойную культуру клеток. Затем инкубируют инфицированную культуру и учитывают результаты реакции, В качестве антителосодержащей жидкости используют лимфоциты. Способ позволяет идентифицировать возбудитель по ранней стадии заболевания.

В настоящее время в вирусологии широко используется РН, которая позволяет 2 идентифицировать возбудителей, вызвавших заболевание, и определять иммунный статус организма. PH — это наиболее универсальная, высокоспецифичная реакция, поэтому она служит эталоном при оценке других реакций в вирусологии.

PH основана на способности специфических иммунных сывороток нейтрализо- С) вать инфекционное действие вирусов, т,е. О при контакте вируса с сывороткой, содержащее специфические антитела, нирус тернет 1ча способность к репродукции в чувствительных системах. Смесь вируса и сыворотки испытывают на чувствительной к данному вирусу системе культивирования, Результаты реакции нейтрализации вируса учитывают по отсутствию: а) гибели или патолого-анатомических изменений; б) цитопатического действия, бляшкообразования; r) гемагглютининов.

1797709

Известно много разных модификаций постановки РН, касающихся приготовления смесей вирус-сыворотка, условий инкубирования смесей и учета результатов PH. Для постановки PH используют сыворотку крови, полученные от зараженных животных.

Наиболее чувствительным является титрование антител по методу реакции бляшек.

Известен способ диагностики вирусных инфекций в РН, включающий следующие операции:

1 — готовят разведение вирусов с содержанием 80-120 БОЕ в 0,1 мл;

2 — смешивают разведения иммунной сыворотки, полученной от больных животных, с постоянной дозой вируса и смесь инкубируют в течение 1 часа при 37 С;

3 — монослойную культуру клеток отмывают соленым раствором Хенкса и инокулируют смесью, полученной согласно п.2;

4 — реакцию инкубируют 1 час при 37 С, 5 — во флаконы вносят агаровое покрытие;

8 — после застывания агара, флаконы инкубируют при 37 С в течение 72 часов; .

7 — учет результатов реакции проводят по количеству редуцированных бляшек. Тип вируса соответствует типу иммунной сыворотки, предупредившей развитие бляшек в наиболее высоком титре.

Даннь и способ взят заявителем в качестве прототипа как наиболее близкий по технической сущности и достигаемому результату при использовании.

Существенным недостатком способапрототипа является длительность идентификации возбудителя и постановки диагноза на болезнь, в связи с длительностью получения исследуемого материала, Известно, что в сыворотках крови животных, зараженных вирусом ящура, антитела к возбудителю появляются к четвертому дню IgM, а к 14 дню — IgG.

Этим объясняется то, что для построения постановки реакции используют сыворфтки, полученные от животных не раньше. чем через 7-14 дней после заболевания.

Целью предлагаемого изобретения является ускорение способа, Поставленная цель достигается тем, что в известном способе диагностики вирусных болезней животных в РН, включающей смешивание антителосодержащей жидкости с вирусом, инкубирование смеси при 3? С в течение 1 часа, внесение ее в многослойную культуру клеток с последующим инкубированием, в соответствии с предполагаемым изобретением в качестве антителосодержащей жидкости используют мононуклеарные клетки (лимфоциты) периферической крови.

Предлагаемый способ соответствует критерию изобретения "новизна", так как по сравнению с прототипом он содержит новую совокупность существенных признаков, выраженную в формуле изобретения.

Сведения о сущности предлагаемого решения до неопределенного круга лиц не доводились.

По сравнению с прототипом предлагае10 мый способ отличается тем, что в качестве источника антител используют лимфоциты крови подозреваемых в заболевании животных. В известных аналогичных решениях указанные отличительные признаки в совокупности с известными признаками, указанными в ограничительной части формулы предлагаемого способа, позволяют значительно ускорить исследование иммунного статуса животного, идентификацию возбу20 дителей, так как в известных способах для подобных исследований используют сыворотки крови от переболевших или вакцинированных животных, отобранных не ранее, чем через 7 — 10 дней после контакта с виру25 сом, Известных закономерностей в опубликованных источниках информации не обнаружено, Таким образом, способ, отличающийся

30 от известного признаками, приводящими к ускорению анализа предлагаемым способом, т.е, к положительному эффекту, который неизвестен в аналогичных решениях, отвечает критерию изобретения "сущест35 венные отличия".

Благодаря использованию новой совокупности известных и отличительных признаков, характеризующих предлагаемый способ, достигается положительный эф40 фект, выраженный в цели изобретения; сокращению времени на постановку диагноза и идентификацию вируса, вызвавшего забо, левание, Достижение положительного эф-. фекта, по нашему мнению, можно объяснить

45 тем, что в качестве источника антител используются лимфоциты подозреваемых в заболевании животных.

Известно, что после попадания в организм антигена происходит коммитирование

50 стволовых клеток (лимфоцитов — предшественников), Антитела продуцируются в небольших количествах (10 -10. молекул на клетку) и функционируют только как рецепторы клеточной поверхности.

Наряду с этим в ранний период после введения антигена в организме образуются клетки памяти, Вероятно, в это же время при стимулированном антигенном размножении клона образуются антителосекретирующие клетки либо из коммутированных

1797709 предшественников антителообразующих раствором Хенкса без индикатора. Полученклеток, либо из клеток памяти при повтор- ный осадок клеток ресуспендируют в расной встрече с аналогичным антигеном, От- творе Хэнкса(1:10). Готовят несколько проб личительная особенность В-лимфоцитов суспенэии лимфоцитов по 0,4 мл. К каждой заключается в том, что на их поверхности 5 пробе добавляют по 0,1 мл вируса ящура присутствует легко возбудимый иммуногло- различных типов, адаптированных к культубулин, который играет роль рецептора для ре клеток ВНК-21 и инкубируют при 37ОС в антигена. Пролиферация и дифференциров- течение 60 мин. Смесь центрифугируют при ка B-лимфоцитов после их взаимодействия 1000 об/мин в течение 10 мл, надосадок с антигеном приводят к образованию кле- 10 инокулируют в культуру клеток ВЕК вЂ” 21. Инток, секретирующих иммуноглобулин ы. кубируют 72 часа при 37ОС, Учет результатов

Каждый малый В-лимфоцит имеет прибли- проводят по ЦПД, эительно 100000 молекул рецепторных им- Результаты исследований, характеримуноглобулинов. Уже через 24 часа после зующих эффективность предлагаемого введения вируса (например, ящура) на лим- 15 способа по сравнению с прототипом, предфоцитах обнаруживаются антигенсвязыва- ставлены с таблицах, ющие участки антител, После введения Пример 2, Кровь от подозреваемых инактивированного антигена на мембранах свиней отбирают в стерильные флаконы с лимфоцитов антигенсвязывающие участки гепарином (20 ед/мл крови). Лимфоциты выантител обнаруживаются значительно по- 20 деляют из плазмы, которую получают после зже, При смешивании лимфоцитов, содер- слабого центрифугирования крови в течежащих антигенсвязывающие центры ние 15 мин„при 900 — 1000 об/мин. Плазму антител, с вирулентным возбудителем про- отбирают в центрифужные пробирки, клетисходит образование комплексов, которые ки осаждают центрифугированием при 1200 осаждали центрифугированием, а недоста- 25 об/мин — 15 мин. если в осадке присутствуточную жидкость отбирали и вносили в чув- ют эритроциты, их лизируют добавлением 1 ствительную культуру клеток, При этом мл дистиллированной воды, в течение 30 размножения вируса в клетках не происхо- сек., затем добавляют 10 мл среды 199, дило. вновь центрифугируют, полученный осадок

Если комплексы "антитело-лимфоциты- 30 повторно промывают солевым раствором вирус" не образовались, то после внесения Хэнкса без индикатора, клетки ресуспендив культуру клеток надосадочной жидкости, руют в 1 мл растворе Хэнкса. Готовят несодержащей вирулентный возбудитель, сколько проб лимфоцитов по 0,4 мл с происходила адсорбция вируса на мембра- содержанием 700-1000 тыс. лимфоцитов в 1 нах клеток и в последующем репродукция 35 мл. К одной части пробы добавляют по 0,1 вируса. мл вируса ящура, к другой по 0,1 мл вируса

Для пояснения сущности предлагаемо- везикулярной болезни свиней, к третьей по го способа приводятся примеры его исполь- 0,1 мл вируса везикулярной экзантемы свизования, которые не ограничивают объем ней. Смесь инкубируют 60 минут при 37 С, изобретения. 40 затем центрифугируют и надосадок инокуПример 1. Кровь от подозреваемого лируют в культуру клеток СП, После инкубив заболевании крупного рогатого скота от- рования во флаконы вносят агаровую смесь . бирают в стерильные флаконы с гепарином и после его застывания флаконы инкубиру(20 ед на мл крови), Мононуклеарные клетки ют при 37 С в течение 72 час. Учет результалимфоциты выделяют из стабилизирован- 45 тов проводят по количеству бляшек, Тип ной крови путем центрифугирования в гра- вируса, вызвавшего заболевание, соответдиенте фиколл-пака ("Pharmacla" Швеция). ствует типу возбудителя, размножение коДля этого в центрифужные пробирки поме- торого ингибируется лимфоцитами щают 5 мл фиколла и осторожно наслаивают больного животного, 5млгепаринизированной крови. Центрифу- 50 Пример 3. Кровь от зараженных гируют 40 мин при 2000 об/мин, при темпе- вирусами ящура или иммунизированных ано ратуре 18 С. После центрифугирования в . тигенамй вирусов БЭС или ВБС морских пробирке образуется 4 слоя: I — плазма, ll — свинок отбирают в стерильные флаконы с лймфоциты,! И вЂ” фиколл, tV — гранулоциты и гепарином (20 ед/мл крови). В дальнейшем эритроциты. Взвесь лимфоцитов осторожно 55 проводят исследовайия так, как описано в отбирают пастеровской пипеткой в центри- примере 2. фужные пробирки и отмывают средой 199 . Результаты этих исследований предпутем 5-минутного цеитрифугирования при ставлены в таблицах 2, 3 и 5, 1200 об/мин. Повторную отмывку лимфоци- Пример 4, Кровь отобранную до тов проводят сбалансированным солевым заражения и через три дня после инфициро1797709

Формула изобретения

Таблица 1

Результаты идентификации вируса, вызвавшего ящур у крупного рогатого скота

Титр вируса (Ig ТЦД5о) Дни отбора проб крови сыво откой и ототип лим о итами

ОИЛ94

А22

А22

0 /4194

А22

ОМ194

4,0 + 0,46

4,2 +037

4,24 ч-0,24

4,31 + 0,22

4.08 й0,23

4,3 «+0,36

4.11 +.0,26

4,0 = -0,21

4,15 0,16

4,17 ++ 0,24

3

11

4.0 ": 0,36

4,0 "0,24

3,2 ф 0,17

2;5" 0,11 а

4,3 + 0,11

4,0 + 0,16

4,0 0,17

4,05 «+0,24

3,5 ч 0,5

2,5 =" 0,25

1,8 0,09

1,45 + 0,11

О

42 + 015

4,24 "=0,13

4,0 + 0,23

4,17 + 0,17

3,08 +0,38 вания вирусом ящура овец отбирали в стерильные флаконы с гепарином и в дальнейшем исследования проводят так, как описано в примере 2, Результаты этих исследований пред- 5 ставлены в таблице 6.

Как видно из данных таблицы 1, предлагаемый способ позволяет определять возбудитель, вызвавший болезнь на 3 день после заражения в то время, как способ прототип — 10 на 7 день. Это свидетельствует о явном преимуществе предлагаемого способа перед прототипом. Предлагаемый способ позволяет на 4 дня ускорить идентификацию возбудителя. 15

Результаты, представленные в таблице

2 подтверждают данные. приведенные в таблице 1 и свидетельствуют о возможности использования для постановки РН иммунных лимфоцитов. 20

Учитывая выше приведенные результаты, была изучена возможность определения подтиповой принадлежности вируса ящура предлагаемым способом (таблица 3).

Данные этих исследований свидетель- 25 . ствуют о возможности ранней идентификации штаммов вируса ящура предлагаемым способом.

Способ диагностики вирусных болезней животных в реакции нейтрализации, включающий отбор антителосодержащего материала от испытуемых животных, смешивание его с эталонным вирусом, инку.В серии опытов была показана возможность идентификации возбудителя везикулярной экзантемы свиней предлагаемым способом (табл. 4 и 5).

В таблице 6 представлены данные, подтверждающие ранее приведенные данные (табл.1-5) и свидетельствующие о возможности достижения поставленной цели и на овцах.

Аналогичные результаты получены при использовании для постановки PH лимфоцитов, выделенных из костного мозга и лимФоузлов.

Технико-экономическая эффективность.

Предлагаемый способ диагностики везикулярных болезней с помощью реакции нейтрализации по сравнению с прототипом дает возможность сократить время определения возбудителя в реакции нейтрализации на 4-11 дней, Ускорение идентификации возбудителей инфекционных болезней имеет большое значение для своевременного купирования очага, а в последующем и ликвидации его, Предлагаемый способ относится к категории изобретений, не создающих экономию при использовании. бирование смеси, внесение ее в монослойную культуру клеток, инкубирование инфицированной культуры и учет результатов реакции, отличающийся тем, что, с . целью ускорения способа, в качестве антителосодержащего материала используют лимфоциты.

Титр вируса ящура (Ig ТЦДж) после инкуба10

1797709

Таблица 2

Изучение возможности постановки реакции нейтрализации с лимфоцитами морских свинок зараженных вирусом ящура Агг № 550

Таблица 3

Результаты исследования лимфоцитов морских свинок, зараженных вирусом ящура типа А

¹¹ nn

БОЕ

Опыт контр.

Время отбора лимфоцитов (часы) Лимфоциты

А ¹ 717

Агг

10

Агг

А № 717

Агг

120

АN 717

Агг

192

А № 7171

240

Агг

А ¹ 717

15 дн

Агг

А ¹717

19 дн

Агг

А ¹717 опыт контр, опыт контр.. опыт контр. опыт контр. опыт контр. опыт контр. опыт контр. опыт контр. опыт контр. опыт контр. опыт контр. опыт конт .

79

97., 67

979

57, 610

119

28

199

164

229

67

68

97 .7

97

61

23

61

68

68

79

19

79

29

112

38

112

9

123

186

99

137

11

186

41

29

22 . 270

24 .

158

158

73

21

73

11

34

34

20 °

44

83

83

27

27

1797709

Таблица 4

Результаты исследований лимфоцитов свиней, зараженных вирусом ящура А22

Таблица 5

Результаты исследований лимфоцитов морских свинок иммунизированных антигеном вируса ВЭС А-4&

Таблица 6

Результаты исследования лимфоцитов овец предлагаемым способом п = 7

Составитель В.Мищенко

Техред М.Моргентал Корректор Н, Бучок

Редактор

Заказ 669 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101