Способ очистки поверхностного антигена вируса гепатита в (нв @ а @ )

 

Использование: изобретение может быть использовано для создания высокочувствительных диагностикумов для определения маркеров вируса гепатита В. Цель: повышение иммунореактивности препарата , а также обеспечение стандартно воспроизводимой чистоты и биологической активности препарата при выделении из сыворотки или плазмы HBsAg положительных доноров как с высоким, так и с низким содержанием HBsAg. Сущность изобретения: сыворотку HBsAg положительных доноров фракционируют сульфатом аммония. После первого равновесного центрифугирования в градиенте плотности раствора галогенида щелочного металла проводят диализ против раствора хлорида натрия. Диализат центрифугируют при (17000-33000) хд в течение не менее 1,5 часов. После второго равновесного центрифугирования проводят диализ против соляной кислоты с рН 1,9-2,3. Диализат подвергают гидролизу пепсином в количестве 3-15 мкг/мл белка и центрифугируют. Положительный эффект: изобретение позволяет обеспечить отечественную технологию высококачественным сырьем для производства диагностикумов для выявления вируса гепатита В. w Ј 1 4 О СЛ

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)s А 61 К 39/12, 39/29

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4872343/14 (22) 09.10.90 (46) 23,11.92. Бюл. N 43 (71) Хозрасчетное опытное предприятие

"Радиопрепарат" Института ядерной физики АН УЗССР (72) Е,О.Калугин, А.С.Щеголев, Т.В.Голованова и M.A.Àáäóêàþìîâ (56) ПатентФранции ¹ 2335237, кл. А 61

К 39/12, 1977.

Патент Франции N 2338051, кл, А 61

К 39/12, 1977.

Патент. Великобритании № 1488774, кл. А 61 К 39/12, 1977, Патент США N. 4088748, кл. А 61

К 39/12, 1978, Авторское свидетельство СССР

¹ 1367199, кл. А 61 К 39/12, 1987.

Диссертация на соискание ученой степени Щеголева А.С. "Совершенствование методов радиоиммунного определения поверхностного антигена вируса гепатита В и антител к нему". Институт вирусологии им, Д,И,Ивановского Академии медицинских наук СССР, 1988.

Изобретение относится к вирусологии, медицинской биохимии и молекулярной биологии и может быть использовано в медицинской промышленности для создания высокочувствительных диагностикумов для. ЯЛ 1776415 À1 (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА В (НВзА9) (57) Использование: изобретение может быть использовано для создания высокочувствительных диагностикумов для определения маркеров вируса гепатита В. Цель: повышение иммунореактивности препарата, а также обеспечение стандартно воспроизводимой чистоты и биологической активности препарата при выделении из сыворотки или плазмы HBsAg положительных доноров как с высоким, так и с низким содержанием HBsAg. Сущность изобретения: сыворотку HBsAg положительных доноров фракционируют сульфатом аммония. После первого равновесного центрифугирования в градиенте плотности раствора галогенида щелочного металла проводят диализ против раствора хлорида натрия. Диалиэат центрифугируют при (17000 — 33000) xg в течение не менее 1,5 часов. После второго равновесного центрифугирования проводят дивлиэ против соляной кислоты с рН 1,9 — 2 3. Диалиэат подвергают гидролизу пепсином в количестве 3 — 15 мкг/мл белка и центрифугируют. Положительный эффект: изобретение позволяет обеспечить отечественную технологию высококачественным сырьем для производства диагностикумов для выявления вируса гепатита В. определения маркеров вируса гепатита В, для изготовления вакцины против гепатита

B. а также в лабораторной научно-исследовательской работе.

1776415

Пригодность препаратов поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) для указанных целей определяется их чистотой, нативностью, биологической (иммунологической) активностью и иммунореактивностью.

Известны способы очистки HBsAg из плазмы и (или) сыворотки HBsAg-положительных доноров, включающие фракционирование исходного материала сульфатом аммония, фракционирование зтанолом по

Кону, осаждение полиэтиленгликолем, криопреципитэцию, равновесное центрифугирование, скоростное зональное центрифуги рова ние, обработку и ротеолити-ческими ферментами, экстракцию хлороформом или алифатичес кими фторсодержащими углеводородами, хроматографические методы, в том числе биоспецифическую хроматографию (1 — 4).

Однако эти способы имеют ряд недостатков. В качестве исходного материала авторы используют сыворотку или плазму с высоким (не ниже 80-150 мкгlмл) содержанием HBsAg, Значительная часть методик включает обработку высокими концентрациями протеолитических ферментов или органическими растворителями. что отрицательно сказывается на нативности препаратов. Большинство методов не позволяют получить препараты высокой чистоты. Практически все методы не обеспечивают получение препаратов с высокой иммунореактивностью, концентрацией, а также стандартно воспроизводимой чистоты и биологической активности препаратов, Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ, описанный в (5), Ъ, Он позволяет выделять HBsAg из различных биологических жидкостей, Метод включает в себя фракционирование сыворотки или плазмы HBsAg-положительных доноров сульфатом аммония, диализ Н 8sAg содержащей фракции против физиологиче-. ского раствора хлористого натрия, двэ равновесных центрифугирования в градиенте плотности раствора галогенида щелочного металла, повторный диализ обогащенного материала и окончательную очистку препарата осуществляют ультрацентрифугировэнией и гельфильтрацией.

Фракционирование исходной плазмы или сыворотки проводят двухступенчато с добавлением сульфата аммония в виде насыщенного раствора на первой ступени до (27-28 ) от насыщения, а на второй — до (42,0 — 42,5 ) от насыщения. Равновесное центрифугирование гомогенного раствора хлористого цезия проводят последовательно дважды с начальными плотностями (1,19- 1,24) г/см и (1,25 — 1,26) г/см соответственно, 5 Использование этого метода позволяет получить препарат MBsAg с химической чистотой не ниже 90, с довольно высокой биологической (иммунологической) активностью (титр в ВИЭФ 1/256 — 1/512) и с им10 мунореактивностью 80 — 85 ф, Препараты, полученные по прототипу, были апробированы в радиоиммунологической тест-системе нэ иммунореактивность по способу (6).

15 Основной недостаток способа заключается етом,,что он не позволяет получить препарат с иммунореактивностью выше 8085, Цель изобретения — повышение имму20 нореактивности и чистоты препарата при выделении из сыворотки или плазмы H8sAg положительных доноров как с высоким, так и с низким содержанием HBsAg, Поставленная цель достигается тем, что

25 в способе, включающем двухступенчатое фракционирование сыворотки HBsAg положительных доноров сульфатом аммония, диализ против хлорида натрия, два центрифугирования диализата в градиенте

30 плотности раствора галогенида щелочного металла, повторный диализ и выделение целевого продукта дифференциальным центрифугированием, после первого центрифугирования дополнительно прово35 дят диализ против раствора хлорида натрия и центрифугирование при (17000 — 33000) xg в течение не менее 1,5 часов, а повторный диализ проводят против раствора соляной кислоты с рН 1,9-2,3 и в полученный диали40 зат вносят пепсин в количестве 3 — 15 мкг/мг . белка,, Экспериментально установлено, что применение после первого равновесного центрифугирования диализа против физио45 логического раствора хлорида натрия и последующего дифференциального центрифугирования при (17000 — 33000) xg в течение не менее 1,5 часа позволяет получить дополнительную очистку целевого

50 препарата.

Подобранное экспериментальным путем количество пепсина (3-15 мкг/мг белка) позволяет увеличить степень очистки препарата и при этом сохранить его биологиче55 скую (иммунологическую) активность, Использование дифференциального ультрацентрифугирования позволяет сконцентрировать препарат и провести его очистку от продуктов ферментативного гидролиза.

1776415

10

30

40

Таким образом, двухступенчатое фракционирование исходной сыворотки или плазмы с помощью насыщенного раствора сульфата аммония, диализ против хлорида натрия, два центрифугирования диализата в градиенте плотности раствора CsCI, повторный диализ и выделение целевого продукта дифферен циал ьн ым центрифугированием в совокупности с дополнительным проведением после первого центрифугирования диализа против раствора хлорида натрия и центрифугирования при 17000 — 33000 xg в течение не менее 1,5 часов, проведением повторного диалиэа против раствора соляной кислоты с рН 1.9—

2,3 и внесением в полученный диализат пепсина в количестве 3-15 мкг/мл белка дают возможность получить препарат HBsAg c иммунореактивностью не ниже 90% (по прототипу 80 — 85%), с химической чистотой не ниже 95% (не ниже 90% по прототипу) и высокой биологической (иммунологической) активностью (1/512 — 1/1024) по данным ВИЭФ (1/256 — 1/512 по прототипу) с концентрацией препарата в растворе 1 — 2 мг/мл.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Поясняет реализацию способа со средними значениями режимов стадий. Берут 500 Мп плазмы или сыворотки, содержащей HBsAg по данным ВИЭФ 1/8, добавляют 190 мл насыщенного раствора сульфата аммония, перемешивают и выдерживают в течение 2 — 3 ч при 2 — 10 С. По истечении заданного времени проводят центрифугирование на центрифуге G2-2!

"Beckman", ротор IA-14, 12000 об/мин (22100 xg) при температуре 5 С 30 мин. Осадок отбрасывают, к надосадочной жидкости приливают 176 мл насыщенного раствора сульфата аммония, перемешивают и выдерживают в течение 2 — 3 ч при 2 — 10 С, центрифугируют на центрифуге G2-2i "Beckman", ротор IA-14, 12000 об/мин (22100 xg) 30 мин.

Надосадочную жидкость сливают, осадок растворяют в 200 мл дистиллированной воды, доводят объем до 500 мл дистиллированной водой, приливают 366 мл насыщенного раствора сульфата аммония, перемешивают, выдерживают в течение 2 — 3 ч при 2 — 10 С и центрифугируют в тех же условиях. Надосадочную жидкость отбрасывают, осадок растворяют е 200 мл дистиллированной воды и диализуют против 5 л 0,14 M раствора хлористого натрия при комнатной температуре (18-25 C) в течение 48 ч с четырехкратной сменой диалиэного раствора. Диализат центрифугируют на центрифуге G2-21 "Beckman", ротор IA-14, 12000 об/мин (22100 xg), при 20 С, 1 ч, осадок отбрасывают. Осветленный диализат доводят до 300 мл 0,14 М раствором хлористого натрия, Затем в полученном растворе растворяют хлористый цезий до плотности 1,21 г/см и проводят центрифугирование (центрифуга Z-8-70 Spinco, Beckman, ротор 70 Ti, 60000 об/мин — 275000 xg, при 20 С, 60 часов).

Образовавшийся градиент плотности раствора хлористого цезия разделяют на фракции объемом по 1 мл. Фракции. содержащие

HBsAg по данным ВИЭФ, объединяют, диализуют против 2 л 0,14 М раствора хлористого натрия в течение 20 часов с четырехкратной сменой диалиэного раствора. Диалиэат центрифугируют на центрифуге G2-21 "Beckman", ротор IA-20, 18000 об/мин (25300 хд), при 20 С, 2 ч, осадок отбрасывают. В надосадочную жидкость доливают дистиллированную воду до 160 мл, добавляют хлористый цезий до плотности 1,26 г/см и проводят второе равновесное центрифугирование (центрифуга Z-8-70 Splnco, Beckman, ротор 70.1 Ti, 60000 об/мин—

260000 xg, 20 С, 60 ч). Образовавшийся градиент плотности раствора хлористого цезия разделяют на фракции объемом по 1 мл.

Фракции, содержащие HBsAg в ВИЭФ объединяют и диализуют против л раствора соляной кислоты с рН 2,0 в течение 20 ч с четырехкратной сменой диализного раствора,. диалиэат осветляют центрифугированием на центрифуге 62-21 "Beckman", ротор

iA-20, 18000 об/мин (25300 xg), 20 С, 60 мин. В осветленный раствор вносят протеолитический фермент (пепсин, Serva, са

15 milli Апзоп units/mg) из расчета 10 мкг/мг белка в растворе, перемешивают и выдерживают при 37 С в термостате в течение 14ч, Проводят дифференциал ьн ое центрифугирование (центрифуга 2-8-70 Spinco, Beckman, ротор SW 55 Ti, 55000 об/мин—

290000 xg, 10 С, 150 мин). Образовавшийся на дне пробирок осадок растворяют в 5 мл

0,14 M раствора хлористого натрия, Полученный таким образом препарат

HBsAg имеет следующие характеристики: объем 5 мл, концентрация белка 2,3 мг/мл, химическая чистота 97%, иммунореактивность 92%, титр в ВИЭФ 1/1024.

Пример 2. Поясняет необходимость диалиэа и осветления HBsAg содержащих фракций после первого равновесного центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия.

HBsAg выделяют иэ 500 мл плазмы, имеющей титр в ВИЭФ 1/4 по примеру 1 до стадии объединения фракций, содержащих

HBsAg по данным ВИЭФ после первого

1776415

Таблица 1

Ста ия очистки

1*

1,2

Таблица 2 равновесного центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия, При этом определяют кратность очистки полученного обьединенного препарата (6). Затем проводят диализ против 2 л 0,14 М раствора хлористого натрия в течение 20 ч с четырехкратной сменой диализнаго раствора, после чего диализат центрифугируют на центрифуге G2-21 "Beckman", ротор lA-20, 18000 об/мин (25300 xg), при 20ОС, 2 ч, осадок отбрасывают и определяют кратность очистки в надосадачной жидкости. Результаты приведены в табл. 1.

Табл. 2 поясняет выбор времени центрифугиравания, Пример 3. Поясняет выбор рН раствора соляней кислоты, НВзАд выделяют из

500 мл плазмы, имеющей титр HBsAg в ВИЭФ 1/8, по примеру 1 до стадии выделения и объединения HBsAg содержащих фракций после второго равновесного центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия. Для проведения диализа готовят растворы соляной кислоты с рН (1,1), (1,5), (1,9), (2,3), (2,7) и проводят диализ против этих растворов в течение 20 часов с четырехкратной сменой диализных растворов. Диализат центрифугируют на центрифуге 62-21 "Beckman", ротор 1А20, 18000 об/мин (25300 хд), 20 С, 60 мин.

В осветленном растворе определяют титр

HBsAg по данным ВИЭФ (табл. 3).

Пример 4. Поясняет выбор концентрации пепсина.

HBsAg выделяют из плазмы, имеющей титр HBsAg в ВИЭФ 1/4, по примеру 1, да стадии осветления после диализа против раствора соляной кислоты. Далее в осветленный раствор вносят пепсин из расчета 2, 3, 10, 15, 30, 50 мкгlмг белка в растворе, выдерживают при 37 С в термостате в течеДо диализа и центрифугиравания

После иализа и ент и ги ования ние 14 ч, после чего проводят дифференциальное центрифугирование на центрифуге

Z-8-70 Splnco, Beckman, ротор SW 55 Tl, 55000 об/мин (290000 xg), 10 С, 150 мин, 5 Для каждой концентрации пепсина определяют содержание HBsAg в осадке по данным ВИЭФ (табл. 4), Затем для каждой концентрации пепсина определяют иммунореактивность пол10 ученного препарата HBsAg (табл, 5).

Положительный эффект — социальный— заключается в обеспечении отечественной технологии высококачественным сырьем в производстве диагностикумов для выявле15 ния вируса гепатита B. Это позволит более полна выявлять носителей HBsAg среди доноров, усилить контроль за качеством препаратов крови, обеспечить проведение специфической иммунопрофилактики в

20 группах повышенного риска по гепатиту В.

Формула изобретения

Способ очистки поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), включающий двухступенчатое фракционирование сыво25 ратки HBsAg-положительных доноров сульфатом аммония, диализ против хларида натрия, два центрифугирования диализата в градиенте плотности раствора галогенида щелочного металла, повторный диализ и вы30 деление целевого продукта дифференциальным центрифугираванием, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения иммунореактивности и чистоты антигена, после первого центрифугиравания допол35 нительно проводят диализ против раствора хлорида натрия и центрифугиравание при

17000 — 33000 xg в течение не менее 1,5 ч, а повторный диализ проводят против раствора соляной кислоты с рН 1,9-2,3 и в получен40 ный диализат вносят пепсин в количестве

3 — 15 мкг/мг белка.

К атность очистки и епа ата

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Составитель Л. Панфилова

Редактор Г. Бельская Техред M.Моргентал Корректор Э. Лончакова

Заказ 4087 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4!5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101