Способ получения антигена вируса марбург
Использование: вирусология. Сущность изобретения: для получения антигена вируса Марбург морских свинок инфицируют дозой (0,5-2.0) 10 LD и выдерживают в течение времени, достаточного для появления 10-20% погибших животных, с последующим тотальным забором крови у оставшихся животных. Из вируссодержащего материала получают вирусный антиген путем центрифугирования. 1 ;збл., 4 ил.
COIO3 СОВЕТСКИХ
ГОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРГТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ (21) 5005133/13 (22) 14.10,91 (46) 07.04,93. Бюл. N 13 (71) Научно-производственное объединение
"Вектор" (72) А, M. Шестопалов, А,А. Букреев, А,А.Скрипченко, В.Г.Фролов и Ю.M.Ãóñåâ (73) Научно-производственное объединение
"Вектор" (56) Итоги науки и техники. Серия "Вирусология", M.. 1991, т.25, с.22 — 23, 27, 32 — ЗЗ.
Physicochemical propeties of Marburg
virus: evidence for three distinct virus
strains and their relationship to Eboia virus.
M,P.Kiley, N,J. Сох., L.Í.ЕИоЛ "J.Gen,ÈroÃ., 1988, N. 69, р.1957 — 1967.
Изобретение о носится к вирусологии и может быть использовано при разработке и получении иммунобиологических препаратов на основе очищенных вирусных антигенов, Целью изобретения является увеличение выхода вирусного антигена и снижение сроков его наработки.
Поставленная цель достигается тем, что морские свинки инфицируются дозой (0,5-2,0) 10 ОБо, достаточной для возникновения заболевания; и выдерживаются в течение времени, достаточного для появления 10 — 20% погибших животных, с последующим проведением тотального забора крови у оставшихся животных. Далее из вируссодержащего материала выделяют и очищают вирусный антиген путем центрифугирования или центрифугирования и гель-хроматографии на макропористых стеклах.
„„5IJ„„1808013 АЗ (я)л С 12 N 7/00 А 61 К 39/12 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА МАРБУРГ (57) Использование: вирусология. Сущность изобретения: для получения антигена вируса Марбург морских свинок инфицируют дозой (0,5-2.0) 10 LD и выдерживают в течение времени, достаточного для появления 10 — 20% погибших животных, с последующим тотальным забором крови у оставшихся животных. Из вируссодержащего материала получают вирусный антиген путем центрифугирования. 1; абл., 4 ил.
По сравнению с прототипом новыми являются следующие признаки способа.
Морские свинки инфицируются дозой (0,5 — 2,0) 10 LDso, выдерживаются в тече3 ние времени, достаточного для появления а
10 — 20% погибших животных, а забор крови О() проводят тотально у оставшихся животных.
Сравнение данного способа получения
1,ф препаративных количеств вируса Марбург с известными показывает. что отличительные Г
1 от прототипа признаки проявляют новые, неизвестные ранее свойства, выявленные e,(iä процессе экспериментов, а именно: при инфицировании морских свинок укаэанной дозой имеет место максимальное накопление вируса в крови эа 1 — 2 сут до гибели животного; для морских свинок, инфицированных дозой (0,5-2) 10э LDso, сроки инкубации сокращаются, 50%-ная гибель животных наблюдается на 7 сутки после заражения. что позволяет с большой точно1808013 стью прогнозировать сроки забора крови с максимальным содержанием в ней вируса; срок забора крови, определяемый наличием
10-20 падежа животных, соответствует. периоду, когда наибольшее количество сви- 5 нок (примерно 70 ) имеют максимальное содержание вируса в крови, При этом электронно-микроскопическим исследованием было дополнительно показано, что физический титр вируса Марбург в крови морских свинок, наработанного по данному способу, достигает величины порядка 10
1О
10 вирионов на 1 мл при инфекционном титре 7,5 — 8,5 lgLDv, что на 3 порядка превышает концентрацию вирусных частиц при использовании для наработки клеточных культур, На фиг.1 приведена зависимость титра вируса Марбург в крови морских свинок от времени, предшествующего их гибели, и инфицирующей дозы, где: 1 — накопление вируса в крови при дозе заражения 10 Ощ;
2 — то же, (1-2) 10 1 Вю; 3 — то же, (5 — 20)»
p LDw; на фиг.2 приведена динамика гибели морских свинок в зависимости от инфицирующей дозы (по результатам многолетних наблюдений при титровании вирусного материала на морских свинках), где: 1 — доза заражения 10 LDgo; 2 — то же, (0,5 — 2) 10
LDm; 3 — то же, (0,5-2) 10 LDgp; 4 — то же, (0,5 — 2) 10 LDgo, на фиг.3 приведена диаграмма по определению оптимальных сроков взятия крови у животных при дозе заражения (0,5 — 2) 10 10щ; на фиг,4 приведена микрофотография очищенного вируса Марбург.
В работе использовался вирус Марбург, полученный в Белорусском НИИ эпидемиологии и микробиологии М3 СССР, Титрование вирусного материала осуществляли на морских свинках при внутрибрюшинном заражении, вычисление значений LDgo проводилось по методу Кербера (8). Материал для инфицирования животных представлял собой 10 гомогенат печени морской свинки на растворе Эрла, предварительно отгитрованный и разведенный до концентрации, обес- 45 печивающей получение необходимой дозы при заражении животного. Идентификация вируса Марбург в очищенных препаратах проводилан с помощью электронной микроскопии, электрофореза вирусных белков в ПААГ(полиакриламидном геле) и в реакции ИФА.
Пример 1. Для наработки вирусного материала берут 40 морских свинок весом не менее 350 — 400 г, заражают внутрибрюшинно дозой 2 10 Ющ на одно животное, Экспериментально установлено, что оптимальный срок тотального забора крови у свинок наступает при достижении их летальности 10-20 (5 — 6 сутки), Зависимость числа животных. имеющих максимальный титр в крови 0Т числа павших животных (по диаграмме на фиг.3).
Таким образом, при достижении летальности 10-20 (5-6 сутки), оставшихся животных забивают, тотально собирают кровь в сосуд, содержащий водный раствор гепарина (250 ед. активности на 1 мл крови). Ко времени забора крови примерно у 70-80 оставшихся в живых свинок имеется максимальный титр вируса в крови (см. фиг. 3), Кровь центрифугируют в роторе JA — 14 на установке
J2 — 21 "Beckman", США, при 2000 об/мин в течение 10 мин. Полученную плазму (порядка
100 — 150 мл) наслаивают на 30 /-ный раствор сахарозы íà STE-буфере (0,1 M NaCI; 0,001 M
ЭДТА; 0,01 M трис-НО: рН 75). Соотношение объемов плазмы и раствора сахарозы 3:1, Центрифугирование проводят на установке J2 — 21 в течение 4 ч при 4 С и 18000 об/мин с использованием 4 — 6 пробирок объемом 40мл, Надосадочную жидкость удаляют, осадок из каждой пробирки ресуспендируют в гомогенизаторе Даунса в 5 мл
STE-буфера, полученную суспензию центрифугируют в 20 — 60 градиенте саха розы на роторе
SW — 40 в течение 8 — 10 ч при 45000 об/мин, Выход конечного продукта составляет порядка
4 — бмгс концентрацией белкадо2 мг/мл(по Лаури) с физическим титром до 3 10 вирионов/мл, Пример 2, 50 морских свинок весом
200 — 300 r заражают дозой 5 10 LDvo. При достижении летальности 20 животных забивают и тотально собирают кровь в сосуд с гепарином (250 ед. активности на 1 мл крови). В соответствии с диаграммой (фиг.3) на данный момент времени почти у 90 непогибших морских свинок имеется максимальный титр вируса в крови. Кровь центрифугируют на установке J2 — 21 при 2000 об/мин в течение
10 мин. Полученную плазму (80-120 мл) наслаивают на 30 раствор сахарсзы Ha STEбуфере, центрифугируют на установке
J2 — 21 в течение 4 ч при 4 С и 18000 об/мин.
Осадок из каждой пробирки гомогенизируют в 5 мл STE-буфера и полученную суспензию подвергают гель-фильтрации на колонке с
МПС, модифицированными поливинилпирролидоном (марка СМП-1М -1000). Элюцию
1808013
Временные затраты на получение 1 мг антигена вируса Марбург
Минимальный требуемый объем исхо ного мате цала
Суммарные, временные затраты, сут
Время на очистку антигена и его аттестацию, сут
Общее время наработки, сут
Количество циклов
Время на концентрирование (получение плазмы) на
1 цикл, сут
Необходимое количество циклов
Способ
Время на 1 цикл, сут всего за
1 цикл
16-18 л бл
Аналог
Прототип
20-200 мл
20200** мл
10 в день забора к ови при этом проводят фосфатным буфером с
0,15 М NaCI, рН 7,5, Выход конечного продукта составляет около 6 — 8 мг вирусного белка с концентрацией не ниже 0,1 мг/мл, Пример 3. (Использование дозы заражения больше 2 10 LDso). з
40-50 морских свинок весом не менее
350 — 400 г заражают внутрибрюшинно дозой
10 LDv, При достижении летальности 10—
20% забор крови и выделение антигена проводят аналогично примеру 1. Выход антигена при этом примерно в 10 — 20 раз ниже. чем в примере 1. Меньшее накопление вируса в крови объясняется быстрым развитием болезни и поражением внутренних органов с последующей гибелью животных (см. фиг,1).
Пример 4. (Использование дозы ,заражения меньшей 5 10 LOS).
50 морских свинок весом 200 — 300 r заражаютдозой10 LDm. Придостижениилеталь- 20 ности 20% забор крови и вьделение антигена проводят в соответствии с примером 1. Выход антигена вируса Марбург примерно в 2 раза ниже, чем в примере 1. Это объясняется тем, что у половины оставшихся в живых морских 25 свинок титр вируса в крови не достиг своего маскимального значения (см. фиг.2), Технико-экономическая эффективность способа, Преимущество данного способа можно 30 показать на примере выделения 1 мг вирусного антигена по сравнению с прототипом и аналогом. При работе с особо опасными инфекциями затраты, связанные с эксплуатацией инженерных систем специальных лаборатор- 35 ных помещений повышенной безопасности. и на заработную плату персонала, в данном случае, многократно превышают стоимость используемых материалов, Поэтому при сравнении принимались во 40 внимание следующие параметры: сроки наработки вирусного материала, необходимого для получения 1м очищенного антигена, количество циклов наработки; время, необходимое на проведение операций по концентрированию и очистке, Количество циклов определялось из условия одинакового числа занятых в работе людей при использовании одной центрифуги J2 — 21 на стадии концентрирования, Временные затраты при этом приведены в таблице. Как видно из этой таблицы, предложенный способ обеспечивает меньшую (в 1,5 раза) продолжительность цикла получения вирусного антигена. Полученный с помощью заявляемого способа очищенный антиген наиболее целесообразно использовать для производства иммунобиологических препаратов; диагностических си- стем, гипериммунных сывороток и т,п.
Увеличение выхода вирусного материала в предлагаемом способе обеспечивается за счет оптимизации дозы (0,5 — 2,0) 10 LDso инфицирования животных, при которой максимальное накопление вируса в крови достигается за 1 — 2 сут до гибели животного, а также эа счет более точного определения момента забора крови животных, когда концентрация вируса в ней достигает максимального значения. По оценочным данным уровень наработки вируса в крови при появлении первых признаков заболевания примерно на один порядок ниже максимальйо достигаемого уровня (в предлагаемом способе) наработки вируса.
Формула изобретения
Способ получения антигенавируса Марбург, включающий инфицирование вирусом биологического обьекта с последующим инкубированием, выделением и очисткой вируса, отл и ч а ю щ ий ся тем, что из биоловм ских объектов используют морских свинок, инфицирование проводят дозой 0,5 — 2,0 10 LDgo, инкубируютдо появления з
10 — 20% погибших животных, а антиген выделяют из крови оставшихся в живых животных, 1808013
Продолжение таблицы
Необходимов количество циклов
Время на1 цикл, сут
Общее время наработки, сут
Количе.ство циклов
Способ
Минимальный требуемый обьем исходного мате иала всего за
1 цикл
10-20 мл
10-20 мл
Заявляемый способ в день забора к ови
* Инфицирование клеток и снятие урожая проводится с интервалом в 1 день.
** Учитывается, что титр вируса в крови при появлении первых признаков заболевания может быть в 10 раз и более ниже максимально достижимого.
Средний титр вируса в крови, ф U),„/ия
Время, предшествующее гибели животных, сут.
" Г. 7
Время на концентрирование (получение плазмы) на
1 цикл, сут г/ 40 9 / 3 6 э 4 3 2 Г
Время на очистку антигена и его аттестацию, сут
Суммарные, временные затраты, сут
1808013
;,,fs- « . -, " и пи;. г 3 Ф 5 6 7 Х У rc rr 42 t3 1М fS 6
Срок яаблгдени, ci т.
7и".. 2
do
90 к Ф . 7 ю у to tY юг
Вреня наблюдения, сут .
1808013
Редактор
Составитель А,Шестопалов
Техред M.Моргентал КоРРектоР M.Ñàìáîðñêàÿ
Заказ 1395 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент". г. Ужгород. ул.Гагари га 101
