Способ получения 9 @ -гидроксиандрост-4-ен-3,17-диона

 

Использование: фармацевтическая промышленность для получения высокоактивных стероидов прегнанового типа. Сущность изобретения: стерин - как таковой или в виде препарата из стерина и поверхностно-активного вещества (ПАВ) в соотношении 10:1 вносят в водную ферментационную среду и подвергают микробиологической трансформации штаммом Mycobacterium vaccae Zl MET 11052 или штаммом Mycobacterium vaccae 11053. В качестве ПАВ используют блочные сополимеры полиэтиленоксида (полипропиленоксида с содержанием 30-70% полиоксипропиленгликоля или аддукты полиэтиленоксида) полипропиленоксида М,ы -тетра-(оксипропил-пропиол)-М -(2-оксипропил)- диэтилентриамина. Стерин вводят в питательную среду в концентрации от 1 до 25 г/л. При необходимости в ферментационную среду добавляют сорбент типа органического полимера в концентрации от 10 до 160 г/л. Затем сорбент отделяют от кулътуральной жидкости, элюируют ацетоном и целевой продукт выделяют путем перекристаллизации . В качестве сорбента используют полимер, полученный из ЭТИЛВИНИЛ.ОБОГО и дивинилового бензола без полярных групп или с полярными группами на основе акрилового эфира. Получают продукт с хорошим выходом при непродолжительной ферментации с использованием непатогенного штамма микроорганизма. 6 з.п. ф-лы, 3 табл.

СОЮЭ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 Р ЗЗ/00

УДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ДОМСТВО СССР

СПАТЕНТ СССР) ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ н% г»

Ed 4

К; АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (2 ) 7774517/13 (2 ) 26.05.87 (3 ) WP С 12 Р/290529.8 (3 ) 23.05.86 (3 )00 (4 ) 30.08.93; Бюл. N. 32 (7 ) Народное предприятие Йенафарм (DD) (7 ) Зайдель Лотар, Херхольд Клере, Бирке

M хаэль и Ноак Дитер(00) (5 ) IP — Kokai, М 52-57161, к . С 07 J 1/00, 1977.

IP = Kokal. N. 55-85397, к . С 12 P 33/06, 1980. (5 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 9 а-ГИДРОКСИА ДРОСТ-4 — ЕН-3,17-.ДИОНА (5 Использование: фармацевтическая пром шленность для получения высокоактивн х стероидов прегнанового типа.

С щность изобретения: стерин — как таков и или в виде препарата из стерина и пав рхностно-активного вещества (ПАВ) в соотношении 10:1 вносят в водную фермен- . та 1ионную среду и подвергают микробио-. логической трансформации штаммом

: :Изобретение относится к способу полния 9 а -гидроксиандрост-4-ен-3,17-дио9-ОН-АД) из .стеринов путем кробиологического превращения. 9- ОНявляется ключевым продуктом для полния стероидных активных веществ. Иэ го продукта могут быть получены высокоивные стероиды прегнанового ряда, имеие широкие области применения.

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта.

Сущность изобретения..... Ы,, 1837073 А1

Мусаbacterium чассае 21 MET 11052 или штаммом Mycobacterlum чассае 11053. В качестве ПАВ используют блочные сополимеры полиэтиленоксида (полипропиленоксида с содержанием 30-707; полиоксипропиленгликоля или аддукты полиэтиленоксида) полипропиленоксида N,N -тетра-(оксипроII пил-пропиол)-N - (2-оксипропил)1 диэтилентриамина. Стерин вводят в питательную среду в концентрации от 1 до 25 г/л. При необходимости в ферментационную среду добавляют сорбент типа органического полимера в концентрации от 10 до

160 г/л. Затем сорбент отделяют от культуральной жидкости, элюируют ацетоном и целевой продукт выделяют путем перекристаллизации. В качестве сорбента используют полимер, полученный из этилвинилового и дивинилового бензола без полярных групп или с полярными группами на основе акрилового эфира. Получают продукт с хорошим выходом при непродолжительной ферментации с использованием непатогенного штамма микроорганизма. 6 з.п. ф-лы, 3 табл, В основу изобретения положена задача описания усовершенствованного микробиологического способа получения 9 а-гидроксиандросг-а-ен-3,17-диона(9-0Н-дд), который позволяет получить этот продукт при высокой производительности превращения стеринов и существенно более коротких продолжительностях ферментации с хорошим выходом.

Согласно изобретению эта задача решается способом микробиологической трансформации штаммами рода Mycobacterium

1837073 чассае так, что для трансформации данного стерина или смеси стеринов используются штамм M. чассае ZIMET 11052 или штамм М. чассае ZIMET 11053. Используемые согласно изобретению штаммы депонированы в месте депонирования микроорганизмов

ГДР, Центральном институте микробиологии и экспериментальной терапии Академии Наук ГДР, Бойтенбергштрассе 11, ГДР-Йена 6900, эа вышеуказанными номерами регистрации.

Характеристика штаммов.

Штаммы Mycobacterlum чассае ZIMET

11052 и Mycobacterium чассае ZIMET 11053 были проселектированы в отделе микробиологии стероидов института ЦИМЭТ/Йена и депонированы в отделе депонирования штаммов института ЦИМЭТ, Морфология.

После засева косяков (среда примера М

1) микроорганизмами штамма М. чассае

ZIMET 11052 или 11053 и четырех-пятидневного инкубирования при 28-37 С образуется плотный бактериальный газон от желтого до оранжево-желтого цвета, Окрашивание происходит особенно быстро и интенсивно под действием света, но имеет место также в полной темноте (скотохромогения), Масса бактерий штамма М. чассае ZIMET 11052 имеет гладкую влажную и блестящую поверхность. Поверхность массы бактерий штамма М. чассае ZIMET 11053 имеет сухую крошащуюся структуру, На микроскопическом изображении клетки двух штаммов после поверхностного культивирования не проявляют заметных различий, Они имеют длину в 1-4 мкм и ширину в 0,5 — 0,8 мкм, иногда слегка изогнуты и имеют легкое утолщение концов. Можно наблюдать короткие цепочки и клеточные грозди.

После выгла>кивания микроорганизмы обоих штаммов отличаются друг от друга морфологией колоний.

Мус. vaccae ZIMET 11052 (S-форма): колонии круглые, выпуклые, с гладким краем,, с влажным блеском, желто-оранжевого цвета, диаметр около 2 мм.

Мус. чассае ZIMET 11053 — (r-форма), колонии круглые с неравномерным краем, плоские крошащиеся, тупые, желтоватого до бежевого цвета, диаметр около 7 мм.

Находясь в жидкой культуре, штамм

Мус, vaccae ZIMET 11053 обращает на себя внимание сильным агрегатообразованием, Употребление углеводородов и сахарных спиртов микроорганизмом штамма

Mycobacterium чассае ZIMET 11052 и

MycobacterIum. чассае ZIMET 11053 приведено в табл, 1. тилентриамина, Ферментацию целесообразно провести на стадиях предварительного и основного культивирования, ее проводят при темпера40 турах 25 — 35 С в течение 48-96 ч, причем величину рН подбирают в пределах 6,0-9,0.

Далее при необходимости в ферментационную среду добавляют либо сначала, либо в течение культивирования сорбент типа

45 органического полимера в рабочей концентрации 10-160 г/л.

50 В частности при вариантах способа с использованием сорбентов применяют органический полимер, возникший иэ этилвинилового и дивинилового бензена, с полярными группами, в частности, полярны55 ми группами на основе эфиров акриловой кислоты.

Ферментацию можно провести в круглых колбах и широкогорлых склянках различной вместимости, в стеклянных ферментаторах с мешалкой, а также в аппаАмидазная активность штаммов

Mycobacterium чассае ZIMÅÒ 11052 и

Mycobacterium vaccae ZIMET 11053 приведена в табл. 2.

5 Для целей согласно способу по разным вариантам изобретения в аэробных и стерильных условиях культивирования ферментируют штамм М. чассае ZIMET 11502 или штамм М. vaccae ZIMET 11053 в водной

10 питательной среде, содержащей наряду со стерином источник углерода (как например, глицерин, глюкозу, сахарозу, крахмал или лактозу), источник азота (как, например, дрожжевой экстракт, мочевину или гидроли"5 зат казеина). а также минеральные соли.

Для этой ферментации применяют такие стерины, как ситостерин, холестерин, кампестерин, стигмастерин или эргостерин или смеси этих стеринов. Стерин вносится в

20 водную ферментационную среду либо как таковой, либо в виде препарата из стерина и поверхностно-активного вещества (ПАВ), причем рабочую концентрацию стерина подбирают в пределах 1,0 г/л до 50 г/л ферментационного раствора. Применяемые при необходимости препараты иэ стерина и ПАВ подготавливают, смешивая данный стерин способом мокрого помола, лиофилизации или распылительной сушки с ПАВ на30 зываемых ниже групп А или В, причем долевая часть ПАВ в готовом препарате составляет 1,0-2,0 мас. .

Под ПАВ групп А или В понимают блочные сополимеры полиэтиленоксид(ПЭО) по35 липропиленоксид (ППО) с удельным весом

30 — 70 / пол ипропиленгликоля или

ПЭО/ППО-аддукты N.N -тетра(оксипропилII пропион)-М -(2-оксипропил)-диэ1837073 р тах из коррозиестойкой стали. По окончан 4и ферментации образовавшийся 9-0НА получают по варианту способа без с рбента, собственно известным образом, э страгированием органическими раствор телями, предпочтительно бутилацетатом, с оследующей кристаллизацией.

При варианте способа с использование сорбента очистку начинают с отделения с рбента от культуральной жидкости, преди чтительно путем фильтрации, а 9-ОН-АД и лучают, наконец элюированием сорбента о ганическими растворителями, такими, к к метанол, этанол или ацетон или же водн ми растворами таких средств, концентр рованием элюата примерно до 10 и ходного объема с повторной фильтрац ей, а также перекристаллизацией.

В предпочтительном варианте способа, и и котором ферментировали клетки штамм ZIMET 11053 в среде с добавкой 140 г/л с рбента вышеуказанной характеристики в те ение 96 часов при 28 С, в зависимости от и именяемого количества стерина в масшта е круглой колбы был получен выход 9О -АД в .пределах 35 — 50 мас. (а алитические значения), причем было уста овлено остаточное содержание стерина м нее 5 вес. %. Как оказалось, в этих услови х способа используемый сорбент вышеук занной характеристики оказывает не то ько благоприятное влияние в отношении оч стки получаемого 9-ОН-АД, более того, в результате достигается повышенное образо ание продукта, и тем самым, повышенн е использование стерина. Обобщая, м жно сказать, что преимущества способа за ючаются в том, что продукт 9-ОН-АД м жет быть получен при небольшой продолж тельности времени ферментации и с хор шим выходом при использовании ш амма микроорганизма, классифицирова ного как непатогенного, и что при вариан е способа с добавкой сорбента продукт

9- Н-АД не только удаляется из культурально жидкости, но дополнительно достигаю я еще и более высокие выходы продукта (с . табл. 1).

Пример 1. Микроорганизмы

М cobacterium чассае ZIMET 11053 культиви уют в течение 7 дней при 28 С на агарово косяке следующего состава: 20 r гл1 церина„5 r бакто-пептона, 5 г мясного эк тракта, 15 г агар-агара, дистиллированно воды на 1000 мл, рН 7,0 (культура в пр бирках).

; Смытыми клетками каждой пробирки за евают круглодонные колбы .вместимост ю 500 мл. содержащие по 50 мл питательно жидкости следующего состава: 10 г стью 500 мл загружают каждую 4 г сырого сорбента вышеуказанной характеристики, 500 мг препарата из ситостерина и ПАВ (500 мг ситостерина, 50 мг ПАВ группы В, растворенные в бензене и лиофилизированные) и

45 50 мл ферментационной среды состава согласно примеру 1.

Выход 9-ОН-АД составлял в среднем

90,6 мг на круглодонную колбу после 96-часовой ферментации на круговой качалке при

SO 28ОС.

Пример 3. Микроорганизмы штамма

Mycobacterivm чассае ZIMET 11053 выращивают в соответствии с условиями примера 1 на пробирочной и жидкой

55 предварительной культурах.

Условия для ферментационной культуры подбирают по аналогии с примером 1, однако отпадает добавка сорбента.

40 глицерина, 10 rдрожжевого экстракта,,0,,5 г

КН2РО4,1,5 г (йн4)2ВР04, 0,2 г М9304 х

x7HzO, 0,01 г FeS04 7Н20, 0,002 г ZnS04 х

x7HzO, дистиллированной воды на 1000 мл, рН 7,0.

Через 72 ч встряхивания на круговой качалке при 200 об/мин и 28 С используют по 5 мл этой предварительной культуры для засева ферментационной культуры.

Десять круглодонных колб вместимостью 500 мл загружают каждую 7 г сырого сорбента типа органического полимера (возникшего из этилвинилового и дивинилового бензена, с полярными группами на основе эфиров акриловой кислоты), 10 мл препарата из ситостерина и ПАВ (100 г ситостерина, 10 г ПАВ группы В, дистиллированной воды на 1000 мл, мокрого помола) и

50 мл ферментационной среды. В качестве ферментационной среды используют раствор из 5 г глюкозы, 10 r дрожжевого экстракта, 1,3 г К2НР04 ЗН20, 1,5 r (МН4)2НРО4, 0.2 г MgSO4 7Н20, 0,01 г

FeSO4 7Н20, 0,002 г ZnSO4 7Н20, дистиллированной воды на 1000 мл, рН 8,0, Подготовленные таким образом колбы стерилизуют в течение 20 минут при 120 С и засевают после охлаждения, после этого осуществляют 96-часовую ферментацию на круговой качалке при 200 об/мин и 28 С.

Общий выход, определяемый способом тонкослойной хроматографии, составлял в среднем на круглодонную колбу 330 мг 9ОН-АД.

Пример 2. В соответствии с условиями примера 1 по культуре в пробирках и предварительной культуре культивируют микроорганизмы штамма Mycobacterium чассае ZIMET 11052.

Десять круглодонных колб вместимо1837073

После 96-часовой ферментации на круговой качалке при 200 об/мин и 28 С было получено в среднем 120 мг 9-OH-АД на круглодонную колбу.

Пример 4. Культивирование микроорганизмов штамма Mycobacterlum vaccae

ZIMET11053 осуществляют на пробирочной и жидкой предварительной культурах в соответствии со стандартом, названным в примере 1.

В десять круглодонных колб вместимостью 500 мл помещают по 5 г сорбента типа органического полимера (возникшего из этилвинилового и дивинилового бензена, без полярных групп), 5 мл препарата из ситостерина и ПАВ вышеуказанного состава и

50 мл ферментационной среды (состав как по примеру 1).

Ферментацию осуществляют в течение

72 часов при 28 С на круговой качалке после стерилизации колб при 120 С в течение 20 минут и последующего засева.

Из культуральной жидкости и сорбента получают в среднем по 108 мг 9-OH-АД на круглодонную колбу.

Пример 5. Микроорганизмы штамма

Mycobacterium чассае ZIMET 11053 предварительно выращивают согласно условиям примера 1 в культуре в пробирках и жидкой культуре. Условия для ферментационной культуры выбраны по аналогии с примером

1, однако препарат из ситостерина и. ПАВ содержит ПАВ ферман (блочные полимеры .. полиэтиленоксида/полипропиленоксида с содержанием 30-70 полипропиленоксида, .выпуск комбината "Хемише Верке Вуна").

После 96-и часовой ферментации на круговой качалке при 200 об/мин и 28 С образуется в среднем 295 мг 9-ОН-АД на круглодонную колбу.

Пример 6. В таких же условиях, как указано в примере 1, вместо 7 г сорбента используют только 1 r сорбента на круглодонную колбу, Средний выход 9-ОН-АД составляет 170 мг 9-ОН-АД на круглодонную колбу.

Пример 7. В таких же условиях, как указано в примере 1, вместо 7 r сорбента используют 10 r сорбента на круглодонную колбу. Средний выход 9-OH-АД составляет

-310 мг 9-ОН-АД на круглодонную колбу, Пример 8. Ферментационные смеси, содержащие 5 г сорбента на круглодонную колбу, 3 мл суспензии ситостерина и исполь10

55 дрост-4-ен-3 ° 17-диона путем микробиологической трансформации стерина микроорганизмом вида Mycobacterlum

vaccae в аэробных и стерильных условиях в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, о.тл ича ющийся тем,чтодлятрансформации используют штамм Mycobacterlum чассае Zt MET 11052 или штамм

Mycobacterlum чассае Zl MET 11053.

2. Способ по п.1, о тл и чаю щи йс я тем, что стерин вводят в виде препарата из ситостерина и поверхностно-активного вещества в соотношении 10:1.

3, Способ по пп. 1и 2, отл ич а ющий с я тем, что в качестве поверхностно-активного вещества используют вещество из группы блочных сополимеров полиэтиленоксида (полипропиленоксида) с содержанием 30-70 g полиоксипропиленгликоля.

4. Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что в качестве поверхностно-активного вещества используют вещество из группы аддуктов полиэтиленоксида (полипропиленоксида) N,N -тетра(оксипропилпи ропиол)-N -(2-оксипропил)-диэтиле1 нтриамина.

5. Способ по пп. 1-4, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что стерин вводят в питательную среду в концентрации от 1 до 25 г/л.

6. Способ поп,1, отл и чаю щи йс я тем, что. с целью повышения выхода целевого продукта, трансформацию проводят в присутствии сорбента, представляющего собой органический полимер, в концентрации от 10 до 160 г/л, затем сорбент отделяют от культуральной жидкости, элюируют ацетоном и из элюата перекристаллизацией выделяют целевой продукт.

7, Способ по пп. 1-6. о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в качестве сорбента используют полимер, полученный из этилвинилового и дивинилового бензола без полярных групп или с полярными группами на основе акри- . лового эфира. зуемые в таких же условиях, как указано в примере 1, дают средний выход 9-ОН-АД в

135 мг на круглодонную колбу.

Пример 9. В остальном в таких же условиях, как указано в примере 1, исполь---зуют 10 г сорбента и 13 мл суспензии ситостерина.

Формула изобретения

1. Способ получения 9 а-гидроксилан10

1837073

Таблица 1

11053

11052

-арабиноза

-рамноза альтоза езоиноэит

Таблица 2

Амиды

11053

11052

Ф цетамид енэ амид очевина глеводороды или сахарные пирты -ксилоэа

-глюкоза

-манноза

-гала ктоза

-фруктоза актоэа ахароза

-сорбит

-маннит эоникотинамид

Цикотиндмид ирази нам ид (алициламид

/ ллантоин (укцинамиД !

Цалонамид

Mycobacterium чассае ZlMET

Mycobacterium vaccae ZlMET

1837073

Таблица 3

Перечень параметров продуктивности при получении 9-ОН-АД при помощи штаммов

MycobacterIum vaccae ZIMET»052 и ZIMET 11053 по сравнению с опубликованным состоянием техники

Масштаб Сорбент (г/л) Штамм

Публикация стеринэ (г/л) 500-мл

M. чассае

ZIMET кр. колба по 50мл

140

11053

Пример 1

6,6

М. чассае

ZIMET

10

Пример 2

»052

1.8

M. vaccae кр. колба по 50 мл

96

Пример 3

2,4

500-мл кр. колба по 50 мл

100

72

4,2

Пример 4

Патент

Склянки на качалке

М. чассае

» Ci-»O4

»053

200

0,83

M.Логв !то т

336

В-8»9

Составитель О.Комарова

Техред М.Моргентал Корректор А,Козориз

Редактор

Заказ 2855 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

»3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

JP 8085397

/Мицубиши/

Патент

DD 127455

/Апджон/

ZIMET

»053

M. чассае

ZIMET

»053

500-мл кр. колба по 50 мл

500-мл

500-л склянки на качалке по 100 мл

Начальная концентраЦИЯ СИТОВремя фер- Выход ментации (ч) 9-ОН-АД (г/л)