Способ получения алкогольоксидазы высших спиртов

 

Использование: в биотехнологии, касается получения фермента алкогольоксидазы высших спиртов. Сущность изобретения: фермент получают последовательным фракционированием солюбилизированной микросомальной фракции парафинокислящих дрожжей полиэтиленгликолем 6000 при его конечной концентрации 6 - 8% в присутствии 0,8 - 1,2% холата натрия и 0,08 - 0,12% тритона Х-100 и гидрополом 294 при его конечной концентрации 8 - 10% в присутствии 0,8 - 1,2% холата натрия и 0,8 - 1,2% тритона Х-100 с последующим высаливанием целевого продукта из полимерной фазы сульфатом аммония при конечной концентрации последнего 18 - 20% от насыщения. При необходимости получения хроматографически однородного препарата целевой продукт хроматографируют на гидроксилапатите в 10 - 300 мМ градиенте калий-фосфатного буфера рН 6,8. 1 з.п.ф-лы, 3 табл., 5 ил.

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения фермента алкогольоксидазы высших спиртов, находящего применение в экспериментальных исследованиях.

Алкогольоксидаза высших спиртов впервые была получена в 1988 г. из парафинокисляющих дрожжей. Способ ее получения заключался в том, что парафинокислящие дрожжи разрушают, отделяют клеточный дебрис, из бесклеточного гомогената осаждают микросомальную фракцию, солюбилизируют ее в присутствии 2% холата натрия, солюбилизат подвергают гель-фильтрации на сефарозе 4В, гель-фильтрации на сефарозе 6В, двухстадийной афинной хроматографии на АН-сефарозе. Выход фермента составлял 14,1%, а удельная активность полученного препарата не превышала 2,1 Е/мг белка.

Цель изобретения - упрощение технологии получения фермента до уровня его препаративного получения в промышленных условиях при одновременном повышении выхода и удельной активности препарата.

Цель принципиально была достигнута в результате того, что выделение фермента осуществляли последовательным его фракционированием в двух системах, в первой из которых алкогольоксидаза высших спиртов проявляла в большей степени гидрофильность, чем примесные белки, а во второй - большую гидрофобность по сравнению с посторонними белками, с последующим высаливанием целевого продукта.

Создание различных условий гидрофильности достигалось подбором фракционирующих агентов и различным соотношением концентраций холата натрия и тритона Х-100 на этих стадиях фракционирования. Практически этот принцип был реализован таким образом. В качестве первого фракционирующего агента использовали полиэтиленгликоль 6000 и фракционирование проводили в присутствии 0,8-1,2% холата натрия и 0,08-0,12% тритона Х-100, а в качестве второго фракционирующего агента - гидропол 294 и фракционирование проводили в присутствии 0,8-1,2% холата натрия и 0,8-1,2% тритона Х-100. На первой стадии фракционирования конечная концентрация полиэтиленгликоля 6000 составляла 6-8% , а на второй стадии фракционирования конечная концентрация гидропола 294 составляла 8-10%. Заключительное высаливание фермента достигалось при конечной концентрации сульфата аммония 18-20% от насыщения.

Сущность предложенного способа заключается в следующем.

Биомассу парафинокислящих дрожжей разрушают, отделяют клеточный дебрис, из надосадочной жидкости осаждают микросомальную фракцию с помощью полиэтиленгликоля, солей кальция или другим методом. Оптимальная конечная концентрация полиэтиленгликоля составляет 5-7%. Полученный осадок суспендируют в фосфатном буфере, содержащем 10-20% глицерина, и солюбилизируют в присутствии 0,8-1,2% холата натрия и 0,08-0,12% тритона Х-100, после чего проводят первичное фракционирование полиэтиленгликолем, добавляя его до конечной концентрации 6-8% . Наиболее удобно использовать 0,05-0,08М фосфатный или аммоний-фосфатный буфер рН 7,4-7,8 и полиэтиленгликоль с мол.массой 6000. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, вновь суспендируют в буферном растворе и солюбилизируют в присутствии 0,8-1,2% холата натрия и 0,8-1,2 тритона Х-100, после чего осуществляют повторное фракционированием гидрополом 294 при конечной концентрации фракционирующего агента 8-10%. Полимерную фазу отделяют центрифугированием и насыщают ее сульфатом аммония до конечной концентрации 18-20% от насыщения, а повторным центрифугированием отделяют нижнюю солевую фазу и освобождают ее от солей диализом.

При необходимости получения фермента в виде хроматографически гомогенного белка можно подвергнуть полученный целевой продукт дополнительной хроматографической очистке на гидроксилапатите в 10 - 300 мМ градиенте калий-фосфатного буфера рН 6,8.

Все технологические операции предложенного способа желательно проводить при пониженной температуре, например при 4^оС в присутствии стабилизаторов, таких как ЭДТА (0,1 мМ) ДТЕ (0,1 мМ). Для воспроизводимости результатов следует ориентироваться на поддержание в рабочих системах стандартного уровня белка в пределах 10-415 мг/мл.

В табл. 1 приведено пооперационное сравнение предложенного способа со способом-прототипом, откуда видно, что известный способ состоит из восьми основных операций, а предложенный способ ограничивается семью основными операциями, а также то, что предложенный способ исключает или сводит к минимуму необходимость проведения малопроизводительных и дорогостоящих этапов хроматографической очистки.

В результате осуществления предложенного способа без дополнительной стадии хроматографической очистки выход целевого продукта составляет в среднем 51%, его специфическая активность 14 Е/мг, степень очистки 10,6 раза. После дополнительного этапа хроматографической очистки выход целевого продукта составляет 38% , его специфическая активность 45 Е/мг, степень очистки 37 раз.

Таким образом, при сравнимой степени чистоты (при удельной активности на уровне 2 Е/мг белка) предложенный способ позволяет повысить выход алкогольоксидазы высших спиртов на 52% по сравнению со способом-прототипом.

В табл. 2 показаны характеристики эффективности отдельных этапов получения целевого продукта.

Достижение цели при реализации предложенного способа возможно только при использовании его всех существенных отличительных признаков. В частности, важным является соблюдение соотношений концентраций холата натрия и тритона Х-100 на каждом этапе фракционирования.

На фиг.1 показана зависимость выхода алкогольоксидазы высших спиртов и цитохрома Р-450, сопутствующего этой алкогольоксидазе, на этапе первичного фракционирования солюбилизированной микросомальной фракции дрожжей от соотношения концентраций холата натрия и тритона Х-100. Использовалась микросомальная фракция дрожжей с удельным содержанием алкогольоксидазы 1,8 Е/мг белка и с удельным содержанием цитохрома Р-450 0,48 нМ/мг белка. Реакционная среда состояла из 0,075 М аммоний-фосфатного буфера рН 7,6 и полимера в конечной концентрации 8%. Концентрация холата натрия составляла 1%, время фракционирования 120 мин. Разделение фаз проводилось центрифугированием смеси в течение 45 мин при 10000g).

Представленные результаты показывают, что при 0,8-1,2% концентрации тритона Х-100 и 1%-ной концентрации холата натрия алкогольоксидаза высших спиртов и сопутствующие гидрофобные белки, в т.ч. цитохром Р-450, полностью (на 80-100% ) переходят в фазу полиэтиленгликоля, т.е. в раствор. В то же время при 0,08-0,12% -ной концентрации тритона Х-100 основная часть алкогольоксидазы высших спиртов остается в осадке, а более 80% цитохрома Р-450 находятся в фазе полиэтиленгликоля, т.е. в растворе.

Представленные данные показывают, что при концентрации холата натрия 1% и концентрации тритона Х-100 на уровне 0,08-0,12% достигается наиболее полное отделение алкогольоксидазы высших спиртов от гидрофобных белков, в частности цитохрома Р-450, и достигается наибольший выход алкогольоксидазы высших спиртов.

Следовательно, на первичном этапе фракционного выделения алкогольоксидазы высших спиртов оптимальное соотношение концентраций холата натрия и тритона Х-100 составляет примерно 10:1.

Базовая концентрация холата натрия 1% взята за оптимальную, так как при пропорциональном снижении концентраций холата натрия и тритона Х-100 значительно увеличивается время солюбилизации, а повышение концентрации приводит к излишнему расходу реактивов.

Зависимость эффективности фракционирования алкогольоксидазы высших спиртов от концентрации полиэтиленгликоля показана на фиг.2. (Использовалась микросомальная фракция дрожжей, содержащая 1,8 E/мг белка алкогольоксидазы высших спиртов и 0,48 нМ/мг белка цитохрома Р-450. Реакционная среда состояла из 0,075 М аммоний-фосфатного буфера рН 7,6 и соответствующего количества полимера. Концентрация холата натрия составляла 1%, концентрация тритона Х-100 - 0,1%. Время фракционирования 120 мин, разделение фаз проводилось центрифугированием в течение 45 мин при 10000g).

Представленные данные свидетельствуют о наибольшем эффекте разделения алкогольоксидазы высших спиртов и таких гидрофобных белков, как цитохром Р-450, и о наибольшем выходе алкогольоксидазы высших спиртов при конечной концентрации полиэтиленгликоля в пределах 6-8%. В этих условиях 70-80% алкогольоксидазы высших спиртов находилось в осадке, а 75-85% цитохрома Р-450 - в растворе. При увеличении концентрации полиэтиленгликоля наблюдается тенденция сближения концентрации этих ферментов в одной фазе, что снижает эффективность фракционирования.

Таким образом, экспериментальные данные свидетельствуют о целесообразности проведения процесса первичного фракционирования алкогольоксидазы высших спиртов из солюбилизата микросомальной фракции дрожжей полиэтиленгликолем при его конечной концентрации 6-8% в присутствии 0,8-1,2% холата натрия и 0,08-0,12% тритона Х-100, так как любое отклонение от этих режимов снижает эффективность фракционирования.

На первичном этапе фракционирования была решена задача отделения целевого продукта от сопутствующих белковых примесей за счет того, что были созданы условия, в которых алкогольоксидаза высших спиртов проявляла в большей степени гидрофильные свойства, а сопутствующие примеси - гидрофобные свойства. На вторичном этапе фракционирования создавались иные условия, которые способствовали проявлению алкогольоксидазой высших спиртов более гидрофобных свойств, чем сопутствующими белковыми примесями. Для этого фракционирование осуществляли в системе с иным соотношением концентраций солюбилизирующих агентов, а именно при концентрации холата натрия 0,8-1,2% и концентрации тритона Х-100 также 0,8-1,2%, т.е. при соотношении их концентраций 1:1.

Опытным путем было установлено, что гидрофобизация алкогольоксидазы высших спиртов на втором этапе фракционирования, т.е. при фракционировании активной фракции, выделенной в результате первичного фракционирования, наилучшим образом протекает в среде гидропола 294. Соответствующие данные представлены на фиг.3. (Использовалась активная фракция после первичного фракционирования алкогольоксидазы дрожжей с удельным содержанием 1,8 Е/мг белка. Реакционная среда содержала 0,225 М аммоний-фосфатный буфер рН 7,6. Содержание холата натрия составляло 1%, конечная концентрация полимера - 8% . Время фракционирования 120 мин, разделение фаз осуществлялось центрифугированием в течение 45 мин при 10000g).

Представленные данные показывают, что с увеличением концентрации тритона Х-100 наблюдается прогрессивное увеличение содержания фермента в растворе полимера, причем в гидрополе 294 содержание алкогольоксидазы высших спиртов нарастает быстрее. При концентрации холата натрия 1% и концентрации тритона Х-100 также приблизительно 1% в гидрополе оказывается растворенным примерно 90% исходной алкогольоксидазы высших спиртов. Дальнейшее увеличение концентрации тритона Х-100 не представляется целесообразным, поскольку приводит к неоправданному увеличению его расхода.

Эффективность фракционирования алкогольоксидазы высших спиртов в зависимости от конечной концентрации гидропола 294 показана на фиг.4. (Использовалась активная фракция алкогольоксидазы высших спиртов с удельным содержанием 1,7 Е/мг белка. Реакционная среда содеpжала 0,225 М аммоний-фосфатный буфер рН 7,6. Содержание холата натрия составляло 1%, тритона Х-100 также 1%. Время фракционирования 20 мин. Разделение фаз осуществлялось центрифугированием в течение 45 мин при 10000g).

Представленные данные однозначно показывают, что на втором этапе фракционирования оптимальной концентрацией фракционирующего агента - гидропола 294 - является концентрация гидропола в системе, равная 8-10%.

Влияние отношения концентраций солюбилизирующих агентов (холата натрия и тритона Х-100) на эффективность фракционирования алкогольоксидазы высших спиртов на обоих этапах фракционирования показано в табл.3.

Представленные данные показывают, что на этапе первичного фракционирования оптимальное соотношение концентраций холата натрия и тритона Х-100 составляет 10:1. Иными словами, при оптимальной концентрации холата натрия 0,8-1,2% оптимальная концентрация тритона Х-100 должна составлять 0,08-0,12% . Соответственно на втором этапе фракционирования оптимальное соотношение концентраций холата натрия и тритона Х-100 составляет 1:1, что означает, что при оптимальной концентрации холата натрия 0,8-1,2% оптимальная концентрация тритона Х-100 должна составлять 0,8-1,2%. На заключительном этапе высаливания целевого продукта полимерную фазу гидропола 294, содержащую алкогольоксидазу, отделяют и насыщают ее сульфатом аммония до конечной концентрации 18-20% от насыщения.

Зависимость эффективности высаливания от концентрации сульфата аммония показана на фиг.5. (Использовалась активная фракция после активного фракционирования алкогольоксидазы высших спиртов гидрополом 294. Нижняя солевая фаза отделялась центрифугированием в течение 15 мин при 10000g).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что наиболее благоприятное соотношение между выходом алкогольоксидазы высших спиртов в солевую фазу и ее удельной активностью наблюдается при конечной концентрации фракционирующего агента в пределах 18-20% от насыщения.

Таким образом, экспериментальные данные свидетельствуют о целесообразности повторного фракционирования алкогольоксидазы высших спиртов из активной фракции (после первичного фракционирования) гидрополом 294 при его конечной концентрации 8-10% в присутствии 0,8-1,2% холата натрия и 0,8-1,2% тритона Х-100 и последующего высаливания целевого продукта из фазы гидропола (после отделения фазы гидропола от водной фазы центрифугированием) сульфатом аммония при его конечной концентрации 18-20% от насыщения.

Сами по себе приемы высаливания и фракционирования белков и, в частности, ферментов с помощью полиэтиленгликоля и гидропола 294 известны. Однако их конкретное сочетание и используемые режимы в технологии ферментов не описаны и достигнутый при выделении алкогольоксидазы высших спиртов полезный результат не представлялся очевидным, что дает основание полагать, что предложенный способ в целом соответствует критерию "существенные отличия".

Более подробно сущность предложенного способа иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Прессованные дрожжи Candida maltosta 400 г, полученные выращиванием на среде с н-деканом, суспендируют в 1 л 0,1 М фосфатного буфера рН 7,6, содержащего 1 мМ ЭДТА и 0,1 мМ ДТЕ. Дрожжи разрушают в дезинтеграторе МЛ-1 с полистирольными бусами в течение 15 мин при температуре 4^оС. Исходное содержание алкогольоксидазы высших спиртов в гомогенате составляет 12592 Е.

Полученный гомогенат центрифугируют при 7500g в течение 30 мин, клеточный дебрис отделяют. Супернатант промывают на мембране с диаметром пор 0,16 мкм двумя объемами 100 мМ фосфатного буфера рН 7,0, содержащего 0,1 мМ ДТЕ. Отмытую суспензию, содержащую клеточные мембраны, разводят тем же буфером до содеpжания белка 15 мг/мл и добавляют полиэтиленгликоля 6000 до его конечной концентрации 6%, после чего проводят центрифугирование суспензии при 10000g в течение 40 мин.

Первичный этап фракционирования алкогольоксидазы высших спиртов осуществляют следующим образом. Осажденную микросомальную фракцию суспендируют в 0,075 М аммоний-фосфатном буфере рН 7,6, содержащем 10% глицерина, 1% холата натрия, 0,1% тритона Х-100, 0,1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ ДТЕ. Общий объем суспензии равен 980 мл, а содержание белка 9,1 мг/мл. Смесь для солюбилизации посторонних белков выдерживалась 120 мин при температуре 4^оС. (После завершения солюбилизации к системе добавляют 84,7 г полиэтиленгликоля 6000 до его конечной концентрации 8% , смесь перемешивают 60 мин при температуре 20^оС, а затем центрифугируют при 10000g в течение 45 мин. Полученный осадок общей массой 90 г содержит 9000 Е алкогольоксидазы высших спиртов, и суммарный выход фермента на этапе первичного фракционирования составляет 72% (по активности).

Вторичный этап фракционирования алкогольоксидазы высших спиртов осуществляют следующим образом. Активную фракцию, полученную на первичном этапе фракционирования, суспендируют в 0,225 мМ аммоний-фосфатном буфере рН 7,6, содержащем 10% глицерина, 1% холата натрия, 1% тритона Х-100, 0,1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ ДТЕ, и доводят содержание белка до 15 мг/мл. Общий объем суспензии равен 350 мл. Смесь для солюбилизации алкогольоксидазы высших спиртов выдерживают при перемешивании в течение 120 мин при температуре 4^оС. Для отделения от солюбилизировавшейся алкогольоксидазы высших спиртов нерастворившихся белков суспензию центрифугируют в течение 45 мин при 10000g и к раствору приливают 30 г гидропола 294 до его конечной концентрации 8%. Систему выдерживают при перемешивании 20 мин при температуре 20^оС и центрифугируют в течение 45 мин при 10000g. В полимерную фазу вносят 35 г сульфата аммония до его конечной концентрации 18%, выдерживают при перемешивании 15 мин и центрифугируют 15 мин при 5000g. Нижнюю солевую фазу отделяют, диализуют против 10 мМ калий-фосфатного буфера рН 6,8, содержащего 10% глицерина, 0,15% холата натрия, 0,1% эмульгена 913,0,1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ ДТЕ.

После второго этапа фракционирования и последующего высаливания было получено 254 мл раствора алкогольоксидазы высших спиртов с удельной активностью 14 Е/мг. Выход целевого продукта после двукратного фракционирования и высаливания составляет 51% (по активности).

Для получения хроматографически однородного препарата фермента полученный после фракционирования диализат нанесли на колонку гидроксилапатита длиной 20 см и диаметром 1,6 см. Общий расход смолы составил 40 г. После промывания колонки уравновешивающим буфером начали вытеснение фермента 10-300 мМ градиентом калий-фосфатного буфера рН 6,8. Было собрано 50 мл активной фракции с удельной активностью 45 Е/мг белка. Выход алкогольоксидазы высших спиртов после этапа хроматографической очистки составил 38% (по активности).

П р и м е р 2. Процесс осуществляли как описано в примере 1, но на первичном этапе фракционирование проводили полиэтиленгликолем 6000 при его конечной концентрации 6% в присутствии 0,8% холата натрия и 0,08% тритона Х-100, на втором этапе фракционирование выполняли гидрополом 294 при его конечной концентрации 8% в присутствии 0,8% холата натрия и 0,8% тритона Х-100, а высаливание целевого продукта осуществляли при конечной концентрации сульфата аммония 18% от насыщения. После высаливания был получен препарат алкогольоксидазы высших спиртов с удельной активностью 7,5 Е/мг белка и выходом 44% по активности от содержания в гомогенате.

П р и м е р 3. Процесс осуществляли как описано в примере 1, но первичное фракционирование проводили полиэтиленгликолем 6000 при его конечной концентрации 8% в присутствии 1,2% холата натрия и 0,12% тритона Х-100, вторичное фракционирование осуществляли гидрополом 294 при его конечной концентрации 10% в присутствии 1,2% холата натрия и 1,2% тритона Х-100, а высаливание целевого продукта происходило при конечной концентрации сульфата аммония 20%. После высаливания был получен препарат алкогольоксидазы высших спиртов с удельной активностью 10 Е/мг белка и выходом по активности 50% от содержания в гомогенате.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛКОГОЛЬОКСИДАЗЫ ВЫСШИХ СПИРТОВ путем разрушения клеток парафинокисляющих дрожжей, отделения клеточного дебриса, осаждения из супернатанта микросомальной фракции и ее солюбилизации с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что выделение осуществляют фракционированием солюбилизированной микросомальной фракции полиэтиленгликолем 6000 при его конечной концентрации 6 - 8% в присутствии 0,8 - 1,2% холата натрия и 0,08 - 0,12% тритона Х-100, повторным фракционированием ранее выделенной активной фракции гидрополом 294 при его конечной концентрации 8 - 10% в присутствии 0,8 - 1,2% холата натрия и 0,8 - 1,2% тритона Х-100 с последующим высаливанием целевого продукта из фазы гидропола сульфатом аммония при конечной концентрации последнего 18 - 20% от насыщения.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что целевой продукт подвергают дополнительной хроматографической очистке на гидроксилапатите в 10 - 300 мм градиенте калийфосфатного буфера рН 6,8.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7