Способ выделения рибофлавина

 

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: способ предусматривает нагрев полученной после ферментации суспензии рибофлавина с максимальным содержанием сухих веществ при температуре 35 - 55°С в квазианаэробных условиях в течение 6 - 28 ч и при значении pH 4 - 9. Из полученного после индуцированного автолиза раствора, содержащего рибофлавин, последний выделяют центрифугированием, декантированием и сушат. 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к микробиологическому способу получения рибофлавина (витамина В₂), в частности к способу выделения рибофлавина из раствора ферментации.

Известен способ выделения рибофлавина из раствора ферментации, на котором раствор ферментации, содержащий максимальное количество рибофлавина, в течение 15-45 мин нагревают при температуре 50-65^оС с последующим разбавлением 25-100 об. водой, полученный разбавленный раствор подвергают центрифугированию с последующим суспендированием полу- ченного центрифугата в 100-300 об. воде и повторным центрифугированием, и в случае необходимости сушкой центрифугата, причем с целью повышения степени выделения путем солюбилизации протеинсодержащего или подобного протеину материала или его перевода в материал сниженной плотности, поддающийся отделению путем центрифугирования, перед центрифугированием можно обрабатывать раствор протеолитическим энзимом при значении рН 6,0-9,0 в течение 1-5 ч [1] Недостаток известного способа заключается в том, что из-за разбавления получают значительно большее количество суспензии ферментации, подлежащей обработке, вследствие чего значительно повышаются расходы на обработку и потери рибофлавина из-за растворенного в добавленной воде рибофлавина. Кроме того, несмотря на использование сравнительно дорогостоящих протеолитических энзимов, выход не полностью удовлетворяет.

Задача изобретения заключается в развитии способа, позволяющего при ферментации рибофлавина по возможности простым и экономичным образом повысить содержание рибофлавина в сушенном, в частности прошедшем распылительную сушку, продукте ферментации и до минимума сократить потери рибофлавина во время переработки.

Поставленная задача решается в способе выделения рибофлавина из раствора ферментации путем обработки раствора, содержащего максимальное количество рибофлавина, отделения содержащего рибофлавин осадка от раствора и сушки за счет того, что обработку осуществляют в условиях, индуцирующих автолиз полученных клеток.

Под индукцией автолиза понимают образование и активацию собственных внутриклеточных энзимов, разлагающих стенки клеток и протеины.

Автолиз микроорганизмов может индуцироваться путем т.н. факторов стресса в микроорганизмах.

Такими факторами стресса для микроорганизмов являются, например, нехватка питательных веществ, повышение температуры, нехватка кислорода, изменения значения рН и изменения давления или осмотического давления в среде, а также добавление к среде солей, тензидов или жирных кислот и облучение ультрафиолетовым светом или рентгеновскими лучами (Acta Biotechnol, 5, 1985, 2, с. 129-136).

В качестве образующих рибофлавин микроорганизмов можно использовать, например, штамм-продуцент Ashbya gossypii и его мутанты, штамм-продуцент Eremothecium ashbyii и его мутанты, и микроорганизмы родов Candida, Torulopsis, Bacillus или Saccharomyces.

Особенно пригодным фактором стресса является повышение при нехватке кислорода.

Таким образом, у образующих рибофлавин штаммов Ashbya gossypii и его мутантов образование и активацию энзимов, разлагающих стенки клеток и протеины, можно индуцировать путем нагревания раствора ферментации, содержащего максимальный выход рибофлавина, при температуре 35-55^оС, предпочтительно 40-49^оС, в частности 40-48^оС, а именно при значении рН 4-9, предпочтительно 5-8, в частности 6-7, при почти полном исключении кислорода, т.е. без вентиляции, в течение 6-28 ч, предпочтительно 14-24 ч.

Получение рибофлавина путем ферментации или брожения известно. Данный метод включает стерилизацию питающей среды и прививку в нее способного к образованию рибофлавина микроорганизма, например Ashbya gossypii или Eremothecium ashbyii, с последующим инкубированием. При достижении или примерном достижении выхода рибофлавина путем ферментации максимума ферментацию оканчивают. После предлагаемого индуцированного автолиза раствора ферментации рибофлавин можно выделять известным образом путем центрифугирования или декантирования и последующей сушки осадка. Сушку можно осуществлять путем распылительной сушки.

П р и м е р 1. По окончании ферментации рибофлавина, при которой в растворе ферментации достигнуто содержание рибофлавина > 5 г/л, раствор при указанных в табл. 1 значениях рН и при умеренном размешивании без введения воздуха нагревают при температуре 45^оС в течение 17 ч. Затем твердые компоненты нагреваемого таким образом раствора ферментации в лабораторной центрифуге количественно осаждают. Осадок затем сушат до того, как вес больше не изменяется, и определяют содержание рибофлавина в сушенном осадке.

П р и м е р 2. По окончании ферментации рибофлавина в сосуде ферментации емкостью 2000 л, при которой достигнуто содержание рибофлавина > 5 г/л, раствор ферментации в квазианаэробных условиях (умеренное размешивание без введения воздуха) при значении рН, равном 6,8, инкубируют при температуре 45^оС в течение 24 ч. Затем автолизованный раствор ферментации декантируют и подвергают распылительной сушке. При этом содержание рибофлавина в прошедшем распылительную сушку осадке составляет 90 мас.

П р и м е р 3. По окончании ферментации рибофлавина, осуществляемой с использованием штамма Ashbya gossypii, полученный раствор ферментации, имеющий содержание рибофлавина > 5 г/л, при умеренном размешивании без введения воздуха при значении рН 6,5, инкубируют при температуре 45^оС. Несколько раз отбирают пробы, каждый раз по истечении 2-4 ч. Для исследования проб 45 мл пробы подвергают центрифугированию в лабораторной центрифуге при 2200 об. в 1 мин в течение 5 мин. Затем осадок ресуспендируют в одинаковом количестве 0,9% -ного водного раствора поваренной соли и дополнительно центрифугируют в указанных выше условиях. Затем полученный осадок подвергают лиофилизации. Результаты приведены в табл.2.

П р и м е р 4. По окончании ферментации рибофлавина с использованием Ashbya gossypii полученный раствор ферментации, имеющий содержание рибофлавина, превышающее 5 г/л, разделяют и инкубируют.

Пробы затем центрифугируют в лабораторной центрифуге, полученный осадок дважды промывают солевым раствором, ресуспендируют и вновь центрифугируют. Затем осадок лиофилизуют. Полученные результаты приведены в табл.3.

Путем нагревании при температуре 50-60^оС в течение 45 мин (согласно прототипу) достигается лишь открытие содержащих рибофлавин клеток, благодаря чему содержание клеток может вытекать. Поэтому в микроскопическом изображении стенки клеток (в опытах А и Б) полностью сохранились, и биомасса содержится в лиофилизованном осадке. В отличии от этого в условиях автолиза согласно изобретению (опыт 1) клетки полностью разлагаются энзимом, т.е. в микроскопическом изображении раствора ферментации не видно ни клеток, ни стенок клеток.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РИБОФЛАВИНА, предусматривающий нагрев ферментативной суспензии рибофлавина, содержащей максимальное количество рибофлавина, отделение содержащего рибофлавин осадка от жидкой фракции центрифугированием и сушку, отличающийся тем, что нагрев ферментативной суспензии ведут при 35 - 55^oС в квазианаэробных условиях в течение 6 28 ч и pH 4 9.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что нагрев осуществляют при 40 - 49^oС.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что нагрев осуществляют в течение 14 24 ч.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2