Способ получения рибофлавина
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОФЛАВИНА путем глубинного культивирования продуцирующих его микроорганизмов вида Bacillus subtilis в условиях аэрации на.питательной среде. содержащей источник углерода, азота, необходимые минеральные соли в присутствии источников ростовых веществ , отличающийся тем, что, с целью повышения выхода рибофлавина , в качестве продуцирующих рибофлавин микроорганизмов из вида Bacillus;subtilis используют штамм Bacillus subtilis ВНИИгенетика-304 или ВНИИгенетика-304а 2, Способ ПОП.1, отличающийся тем, что культивирование ведут на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода сахар-сырец или мелассу, а в качестве источников ростовых факторов используют белково-витаминный концентрат или его гидролизат или автолизат,или пищевые дрожжи, или дрожжевой экстракт.
„„SU„„,908092
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН за3) С 12 P 25/00
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 2981423/28-13 (22) 04.09.80 (46) 30.12.84. Бюл. N 48 (72) А.Я. Куканова, В.Г. Жданов, А.И. Степанов и В.А. Панова (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (53) 577.16 (088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР
Р 389132, кл. С 12 D 5/04, 1969.
2. Патент США У 3900368, кл. 195-96, опублик. 1976. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОФЛАВИНА путем глубинного культивирования продуцирующих его микроорганизмов вида BaciIIus subtiIis в условиях аэрации на.питательной среде, содержащей источник углерода, азота, необходимые минеральные соли в присутствии источников ростовых веществ, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода рибофлавина, в качестве продуцирующих рибофлавин микроорганизмов из вида
Bacillus subtiIis используют штамм
BaciIIus subtiIis ВНИИгенетика-304 или ВНИИгенетика-304а.
2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что культивирование ведут на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода сахар-сырец или мелассу, а в качестве источников ростовых факторов используют белково-витаминный.концентрат или его гидролизат или автолизат,или пищевые дрожжи, или дрожжевой экстракт.
1 908
Изобретение относится к микробио. логической промышленности, а именно к способу получения рибофлавина (В ).
Витамин Вг широко используется в
5 сельском хозяйстве, в основном в качестве кормовых добавок сельскохозяйственным животным, а кристаллический рибофлавин применяется в пищевой и фармацевтической промышленности.
Рибофлавин получают химическим способом, а также путем микробиологического синтеза.
Известен способ микробиологического производства рибофлавина путем использования культуры гриба Eremothecium ashbyii на соевой ферментационной среде, содержащей гидрол и кукурузный экстракт и . За 96 ч процесса ферментации накапливается до 2000 мг/л В . К недостаткам такого способа следует отнести длительный период роста культуры, вследствие чего увеличивается продолжительность .ферментации,и повышенную чувствитель- ность к загрязнению посторонней микрофлорой.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения рибофлави30 на-витамина В путем культивирования г его продуцентов-микроорганизмов вида BaciIIus subtiIis на питательной среде, содержащей 8 глюкозы в качестве источника углерода, минеральные соли и источники ростовых вещестьЗ5 дрожжевой экстракт, пептон, глутами- новую кислоту, препараты РНК, пурины и аналоги пуринов (2 ). За 44 ч процесса ферментации накапливалось до
560 мг/л рибофлавина.
Недостатками способа является сравнительно низкий уровень активности, достигаемый культурой BaciIIus .subtiIis и необходимость в дорогостоящих и дефицитных компонентах ферментационной и ростовой сред.
Целью изобретения является повышение выхоДа рибофлавина.
Поставленная цель достигается тем, что в способе получения рибофла-5О вина, предусматривающем глубинное культивирование продуцирующих его .микроорганизмов вида BaciIIus subtiIis в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источник угле- SS рода, азота, необходимые минеральные соли в присутствии источников ростовых веществ, в качестве продуци092 2 рующих рибофлавин микроорганизмов .из вида BaciIIus subtiIis используют штамм BacbiIIus subtiIis ВНИИгенетика-304 или ВНИИгенетика-304а.
При этом культивирование ведут на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода сахар-сырец или мелассу, а в качестве источников ростовых факторов используют белково-витаминный концентрат или его гидролизат или автолизат, или пищевые дрожжи, или дрожжевой экстракт.
Используемые штаммы-сверхсинтетики сконструированы генетическими методами из независимо полученных мутаций, каждая из которых приводит к сверхсинтезу витамина:
ros — ribc — AGR (устойчивость к и розеофлавину ros мутация в генерегуляторе ribs, устойчивость к
8-азагуанину AGH). Затем проводилась мутагенная обработка нитрозогуанидином, нитрозометилмочеви " ной, облучение ультрафиолетом и селекция активных вариантов на ферментационной среде °
Штамм ВНИИгенетика-304-прототроф, штамм ВНИИгенетика-304а — ауксотроф с неидентифицированной ростовой потребностью. Оба штамма олигоспорогенные, на всех средах количество спор по сравнению с исходным штаммом снижено на 3-4 порядка.
Способ осуществляют следующим образом.
Культуру ВНИИгенетика-304 или
ВНИИгенетика-304а выращивают на агаризованной среде Хоттингера или мясо-пептонном агаре (МПА) в течение
1-2 суток при температуре 28-37 С.
Затем суспензию клеток передают в колбы с посевной средой, содержащей мелассу, БВК и минеральные соли, либо в картофельную посевную среду, либо МПБ. Посевной материал выращивают в течение 17-24 ч на качалке
200 об/мин, Затем посевной материал передают в количестве 5-103 в основную ферментационную среду. Процесс ферментации осуществляют в колбах
Эрленмейера на качалке, либо в ферментере при интенсивном перемешивании и аэрации в течение 46-50 ч нри температуре 37 С, рН 6,5-7,5 (в начале ферментации) на питательной среде, содержащей источники углерода, например глюкозу, сахаро9080
3 зу, сахар-сырец, мелассу, крахмал источники минерального азота, например соли аммония, мочевнны нитраты; соли фосфора, например, фосфата калия, аммония и другие соли; соли
Mn (MnCI, MnS0 ), а также источ5 ники ростовых факторов, например, биомассу кормового дрожжевого белка (БВК), гидролизаты и автолизаты БВК, пищевые дрожжи, дрожжевой экстракт, кукурузную и соевую муку, кукурузный экстракт., гидролизат казеина, пептон. Через 46-50 часов ферментации в культуральной жидкости накапливается 700-1000 мг/л рибофлавина.
Пример 1. Односуточную культуру ВасiIIus subtЖз ВНИИгенетика-304, выращенную на косяках MIIA пересеивают на жидкую посевную среду, содержащую 6% мелассы, 1% БВК и, 20 минеральные соли, Посевная среда готовится разведением пополам стерильной водой ферментационной среды, состав которой приведен ниже. Выращивание посевного материала проводят в колбах Эрленмейера, объемом
750 мл (объем среды 25-100 мп), на качалке 200 об/мин при 37 С в течение 17 часов и передают в количестве 10% в ферментационную среду следующего состава, %:
Меласса 12
БВК 2 (ИН )2 ЯО 0,2
K III 0 1,4
КН РО 0,6 Ç5
М БО 0,01
Na С Н,О, (цитрат Na) 0,1 РН
7,0-7,2.
Ферментацию осуществляют в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл 40 (объем среды 25 мл) на качалке
20) об/мин при 37 С. Через 48 ч ферментации культуральная жидкость содержит 700- 1000 мг/л рибофлавина.
Пример 2. Аналогичен приме- 45 ру 1, только используют штамм
BaciIfus subtiIis-304a.
Пример 3. В качестве продуцента также используют штаммы
ВНИИгенетика/304. Ферментационная среда и условия ферментации, как указано в примере 1. Отличием является состав посевной среды, которая готовится следующим образом. Картофель очищают от кожуры, режут на 5 куски и заливают небольшим количест- вом воды, после чего стерилизуют при 0,8-1 атм. Посевную среду за92 4. севают с косяков MTIA культура растет в колбах на 750 мл (объем среды 50-100 мл) на качалке при
37 С в течение 24 ч. Ферментацион-о ную среду засевают 10% посевного ,материала, ферментацию проводят, как в примере 1.
Через 48 ч ферментации культуральная жидкость содержит 700-1000 мг/л рибофлавина.
Пример 4. Так же как в примере 3, только используют штамм
BaciIIus subtiIis-304a.
Пример 5. Культура, посевная среда, условия ферментации, как в примерах 1,2 и 3. Отличием является состав ферментационной среды,%:
Сахароза (или сахар-сырец) 12-14
БВК 3-4
Минеральные соли, как в примере 1.
Через 48 ч ферментации культуральная жидкость содержит 7001000 мг/л рибофлавина.
Пример 6. Односуточную культуру штамма ВНИИгенетика-304 с косяков MIIA переносят в посевную среду МПБ, на которой 8-10 ч на качалке при 37ОС готовится-посевной материал. В количестве 10% посевной материал переносится в ферментационную среду, имеющую состав,%:
Глюкоза 8
Дрожжевой экстракт 0 5
Гидролиэат казеина или пептон 0,02
Минеральные соли как в примере 1. рН 7, 1-7,2. Ферментация длится
44-50 ч при 37 С в колбах на качалке 200 об/мин. Через 48 ч ферментации культуральная жидкость содержит 700-1000 мг/л рибофлавина.
Максимальный выход рибофлавина в предлагаемом способе составляет
1000 мг/л за 48 ч роста культуры на синтетических или крмплексных средах, что на 40% превосходит активность штаммов-пр8дуцентов в прототипе. Кроме того, в отличие от указанного прототипа, используют более простые среды, не содержащие дорогостоящих компонентов. .Получение рибофлавина предлагаемым способом обладает рядом преимуществ по сравнению с пействую908092
Культурально-морфологическая характеристика штаммов-продуцентов рибофлавина Вас. subtiIis ВНИИгенетика-304 и ВНИИгенетика-304а.
Штамм ВНИИгенетика-304
Морфология под микроскопом
Морфология на разных средах.
Мясо-пептонный агар (МПА) Спорообразующая граммположительйая палочка длиной 2-3р.
На 1-2 сутки роста при 28-37 С образует колонии с неровным краем, звездчатые,диаметром 3-4 мм, поверхность гладкая, блестящая, цвет желтоватый. Рост rro уколу умеренный, в основном на поверхности среды:
Мясо-пептонный бульон (МПБ) Рост без качания на поверхности бульона в виде пленки.
На 2 сутки роста образует колонии диаметром 2-3 мм, ярко-желтого цвета, флоурисцируют в УФ-лучах желтым цветом, колонии круглые с гладким краем., блестящие
Минимальнж среда
Спицайзена с глюкозой
Не растет на минимальной среде
Растет при 20-42 С, оптимум 3? С рН 5,0-9,0, оптимум 7,0-8,0.
Углеводы: хорошо утилизируют глюкозу, сахарозу, крахмал.
Спирты: утилизируют этанол, сорбитол
Источники азота: хорошо усваивает аммоний, мочевину, нитраты.
Желатину разжижает.
Физиологические свойства
Техред С.Мигунова Корректор А. Ильин
Редактор С. Титова
Заказ 9246/4
Тираж 521 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная,4 щими в настоящее время произволством рибофлавина с помощью аскомицета Eremotheaum ushbyii (базовьи способом). Помимо уже упоминавшейся меньшей требовательности к составу питательных сред в предлагаемом способе почти вдвое сокращается время ферментации (48 ч вместо 72-9б ч), а также уменьшается возможность загрязнения культуры посторонней микрофлорой.
По сравнению с прототипом пред5 лагаемый способ характеризуется более высоким уровнем выхода продукта и возможностью использовать простые и доступные по составу среды-.
